山苍子AFLP反应体系的建立及其引物筛选

通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主要因素(酶切时间、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究,建立了适合于山苍子AFLP分析的技术体系。结果表明,山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料;山苍子基因组DNA经5 U EcoR I和5 U Mse I酶切1 h即可完全酶切;最佳的选择性扩增体系为20 μL反应体系中含有1.0 U rTaq聚合酶、2.0 μL 10×PCR缓冲液、1.8 μL 25 mmol·L^-1MgCl₂、1.4 μL 2.5 mmol·L^-1dNTP、100 ng·μL^-1引物各1.0 μL。使用该反应体系获得了清晰、稳定的DNA指纹图谱,并筛选出10对多态性较好的AFLP引物组合,为利用AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结构、遗传分化等研究奠定了基础。     

闽楠、红楠AFLP反应体系建立

以闽楠、红楠总基因组DNA为模板,对AFLP分析各环节的条件进行了优化和筛选,建立了适合于闽楠、红楠AFLP分析的最佳反应体系.其中:酶切反应条件为在20μL反应体系中,加入模板DNA 150 ng,Buffer22μL,BSA 0.2μL,EcoRI 3U,Msel 2U,37℃酶切4 h,65℃变性10 min,4℃保存;连接反应条件为将酶切产物中加入5μL连接体系(包括T4 Buffer 2.5μL,EcoRI接头5 pmol,MseI接头50 pmol,T4连接酶1U),16℃连接过夜.预扩增反应条件为在20μL体系中,加入稀释25倍的连接产物5μL,Mg2+(25 mM/L)1.6μL,dNTP(2 mM/L)2 μL,预扩增引物E00、M00各30 ng,Taq酶1U.选择性扩增反应条件为:在20μL体系中,加入稀释100倍的预扩增产物5μL,Mg2+ 1.2μL,dNTP 2μL,选择性扩增引物(E+3/M+3)60 ng,Taq酶1U.本实验结果为闽楠、红楠AFLP分析打下了良好的实验基础.     

刺五加AFLP分子标记技术体系的建立

用改良的的试剂盒法提取刺五加叶片的基因组DNA,可以获得高质量的刺五加基因组DNA,DNA降解较少、污染低、电泳条带清晰,可以用于PCR扩增反应,可以被内切酶EcoRⅠ和MseI彻底消化。通过优化酶切反应、引物连接、预扩增、选择扩增,建立了优化的刺五加AFLP分析技术体系,从64对引物中筛选到5对高效扩增引物,并利用这5对引物在6个刺五加种源中获得了89个多态性AFLP分子标记。建立了利用红外荧光检测技术和Li-Cor4300DNA分析系统,进行刺五加AFLP分析的分子标记技术。     

桉树AFLP标记反应体系的建立

为获得桉树种质鉴定、辅助育种所需稳定的分子标记,本研究以生产中常用的24个桉树无性系基因组DNA为材料,对AFLP的反应体系和参数进行优化,发现高纯度的模板最低用量为100 ng;EcoRⅠ、MseⅠ用量不低于0.5 U;酶切连接时间需要大于4 h,但不多于14 h。预扩增获得50～700 bp产物;该产物稀释5倍后用于选择性扩增。聚丙烯酰胺胶电泳检测温度以20℃为佳。     

海南油茶AFLP体系的建立及优化

该文以海南油茶DNA为材料,对AFLP反应体系中的油茶基因组DNA用量、酶切连接反应时间、酶切连接液稀释倍数、预扩增反应产物稀释倍数、Mg2+浓度等5个因素进行优化。结果表明:Eco RI和Mse I酶切连接反应14h需基因组DNA用量为400ng,预扩增反应过程酶切连接液稀释倍数10倍,选择扩增中预扩增产物稀释倍数40倍,两次扩增选用Mg2+浓度均为2.0mmol/L。采用该技术体系得到的AFLP指纹式样清晰,适宜用作海南油茶品种鉴别和遗传多样性分析。     

刺槐AFLP分析体系的建立与优化

以10份刺槐种质资源为试材,通过对影响AFLP反应体系关键因素的优化,建立了刺槐AFLP分析的反应体系,即15ng/μL模板DNA在37℃下双酶切(MseI、EcoRI各0.15U/μL)2h,0.075U/μL T4DNA连接酶连接12h,连接产物、预扩增产物稀释10倍后扩增效果最佳。并利用该体系筛选出引物E+3/M+3,构建了刺槐种质资源的AFLP指纹图谱。     

湿加松MSAP反应体系建立及引物筛选

为建立适合湿加松的MSAP（甲基化敏感扩增多态性）反应体系,以湿加松幼嫩针叶为材料,建立了湿加松MSAP反应体系,即：400ng基因组DNA用EcoRⅠ,HapⅡ或MspⅠ各3U,37℃保温24h。预扩增体系为：酶切-连接产物1μL、上下游引物各1μL、2×PCR mastermix10μL和ddH2O2 7μL。20μL选择性扩增体系中,含有10倍稀释的模板DNA2μL、上下游引物各1μL、2×PCR mastermix10μL和ddH2O2 6μL。利用反应体系,筛选出了13对适宜于湿加松MSAP分析的引物,建立的MSAP反应体系可用于湿加松基因组DNA甲基化差异分析。     

FISH-AFLP分析新疆核桃品种遗传多样性

采用FISH-AFLP技术,选取8对EcoRⅠ+3和MseⅠ+3引物组合,对新疆维吾尔自治区林木品种审定委员会审（认）定的24个核桃品种（无性系）、2株实生古树及4个农家类型在DNA水平上进行了多态性检测。结果表明：在获得的1 011条谱带中,981条呈多态性,多态性百分率达97.5%;不同引物组合的有效等位基因数为1.188 7~1.234 7,平均为1.208 5;基因多样度为0.118 3~0.141 2,平均为0.129 7;Shannon信息指数为0.184 6~0.225 8,平均为0.206 6。总体的遗传多样性水平为中等。经8对引物检测的30个品种及类型均得到数目不等的特异带型,能将30个核桃良种及类型完全区分,建立了它们的指纹图谱。     

枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立

扩增片断长度多态性(AFLP)实验过程中,DNA提取质量和适合的PCR扩增反应体系是2个关键因素.利用CTAB法对枣树叶片DNA的提取方法进行探讨.结果表明:改良CTAB法抽提到了较高质量的枣基因组DNA,可用于AFLP实验分析;通过对酶切-连接体系和PCR扩增体系中的关键因素实验分析,建立了适合枣AFLP荧光反应体系,并得到清晰的DNA指纹图谱.     

环境因子对喙尾琵甲卵孵化的影响

研究了温度、光照和基质含水量对喙尾琵甲(Blaps rhynchopetera Fairmaire)卵孵化的影响。结果表明:12 - 28 ℃ 6个恒温条件下卵均可孵化,随着温度的升高卵的发育历期缩短(32.92 - 5.83 d),发育速率加快(0.03 - 0.172/d)。12 - 25 ℃下孵化率较高,平均孵化率70%,8 ℃和31 ℃未见卵孵化。喙尾琵甲卵的发育起点温度为(10.08±0.93) ℃,有效积温为(99.91±8.11)日·度。在0 - 8 000 lx光照条件下,随着光照度的增加,孵化率呈下降趋势,光照度≥8 000 lx,卵不孵化。基质含水量和温度共同影响试验中,基质含水量、温度以及二者的交互作用均对卵的孵化有显著影响,多重比较分析后筛选出了适宜卵孵化的温度含水量组合;并对云南地区限制喙尾琵甲卵孵化的气候因素进行了探讨。     

连翘叶片总DNA提取方法的比较

以连翘[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]的新鲜叶片为材料,分别采用CTAB法、高盐低pH法和SDS法3种不同方法提取其总DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测获得的DNA的质量,以期从中找出提取连翘总DNA的最适方法。结果表明对于连翘的新鲜叶片,无论从产率上还是质量上,CTAB法都明显优于其他两种方法。     

漾濞核桃叶片基因组DNA的两种提取方法效果比较

以漾濞核桃不同生长期的叶片为材料，采用高盐低pH法和改良CTAB法作提取其基因组DNA的效果比较实验。通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和RAPD扩增对所提取的DNA样品进行检测，比较所得DNA的产量、质量，认为从漾濞核桃不同发育时期叶片中获得DNA的提取效果不同。4种叶样以冬芽和新叶的效果为好，老叶最差；用两种提取方法从叶片中得到的DNA产量和质量有所不同，高盐低pH法提取的DNA纯度高，但是产量较低；而改良CTAB法则相反，产量高，纯度低。     

柳树DNA提取改良方法研究

高质量的DNA是进行林木分子生物学研究的基础与关键。该研究利用改良的CTAB法提取垂柳基因组DNA,并与常规CTAB法、CTAB-硅珠裂解法、SDS法和试剂盒法进行了比较。琼脂糖凝胶电泳检测显示,改良CTAB法提取的DNA浓度和纯度较高,质量优于其他4种提取方法。同时利用改良CTAB法提取了柳树16个自然种及杂交种基因组DNA,并经SSR-PCR扩增反应验证,表明改良CTAB法可作为一种柳树基因组DNA提取的通用方法。     

基于CTAB法提取毛竹基因组DNA的探讨

应用CTAB法、改良CTAB法、改良CTAB-高盐沉淀法对毛竹基因组DNA进行了提取,并用紫外分光光度计(UV3300)、琼脂糖凝胶电泳和PCR分析对提取的DNA进行了检测,对DNA的产量、质量、PCR效果等方面进行了综合比较.结果表明:改良CTAB-高盐沉淀法是提取高质量毛竹基因组DNA的较好方法.     

核桃总DNA提取方法研究

研究了适于核桃基因组DNA的提取方法,并对DNA初步进行了质量检测,结果表明此方法可有效去除次生物质对DNA的干扰,可用于随机引物RAPD扩增和随后的各种遗传学分析.     

一种适合AFLP分析的油茶DNA提取方法

以油茶的成熟叶片为材料提取DNA,40个样品用改良的提取纯化方法成功提取出适用于AFLP分析的高质量DNA,OD260/OD280在1.7-2.0之间,可以用于AFLP反应。该方法打破了仅能用幼嫩叶片作为提取材料的限制,具有更广泛的适用性和重要的实用性。     

Methodological comparison of DNA extraction from Holcocerrus hippophaecolus (Lepidoptera: Cossidae) for AFLP analysis

Amplified fragment length polymorphism (AFLP) is a powerful DNA fingerprinting technique for studying genetic rela-tionships and genetic diversity in insects. However, the crucial prerequisite for AFLP analysis is to extract DNA of high quality. In this study, we evaluate four different protocols (SDS method, improved SDS method, CTAB method and a complex method with SDS and CTAB) for isolating DNA from the seabuckthorn carpenter moth (Holcocerrus hippophaecolus (Lepidoptera: Cossidae)). The results indicate that the CTAB method does not produce DNA suitable for AFLP analysis. The SDS method and the complex method with SDS and CTAB are comparatively time-consuming and resulted in low yields of DNA and were therefore not used for AFLP assay. The improved SDS method is recommended for preparing DNA templates from H. hippophaecolus for AFLP analysis.     

CTAB法提取瓜叶菊不同组织基因组DNA的研究

获得高质量DNA是进行分子生物学研究的基础。通过CTAB法提取瓜叶菊叶、茎、花的基因组DNA,提取的DNA质量良好,电泳条带清晰,提取过程无明显的DNA降解,分子量接近21Kb。以提取的DNA为模板,用一对引物扩增瓜叶菊中与花色相关的特异基因,得到条带单一、大小与已知一致,说明提取的DNA可以满足相关的分子生物学研究。CTAB法提取瓜叶菊不同组织的DNA产率不同,其中叶的DNA产率最大,茎的产量居中,花的最低。