用单胚mRNA差显方法克隆羊早期胚胎发育阻滞形成的相关基因

为探讨山羊体外培养胚胎发育阻滞的发生机理,用单胚mRNA差异显示技术,对来源于体内发育和体外培养的山羊早期8~16细胞期胚胎的基因表达进行了研究,获得体内发育胚胎特异表达的一些片段,并对其中1个片段进行了分析。结果表明,该片段与犬信号肽酶复合体25亚基(SPC25)基因具有92%的同源性。SPC蛋白可通过切除相关前体蛋白的信号肽,成为成熟的分泌蛋白而影响和作用于早期胚胎发育过程。该基因可望对克服早期胚胎发育阻滞有重要作用。     

活性氧对哺乳动物早期胚胎体外发育阻滞的研究进展

哺乳动物早期胚胎体外培养过程中常发生体外发育阻滞现象，活性氧是引起发育阻滞的重要原因之一，作者综合国内外研究报道，综述了活性氧对哺乳动物早期胚胎体外发育的影响及克服发育阻滞现象的方法，为哺乳动物胚胎体外培养提供一些参考。     

哺乳动物早期胚胎体外发育阻滞的产生与克服

哺乳动物早期胚胎发育阻滞是体外培养条件下普遍存在的现象。文中就离体情况下由于生长环境的变化使早期胚胎所遭受到外界因素的影响进行了探析。综合国内外研究报道，提出通过改善培养条件和利用体细胞共培养，克服早期胚胎的体外发育阻滞。旨在为哺乳动物胚胎的体外培养提供一些参考。     

山羊胚胎大动脉壁发育的组织学研究

本文应用光镜和透射电镜对山羊胚胎大动脉壁的发生发育过程进行了系统观察。结果表明：血管发生初期仅由一层内皮细胞构成。随着胚胎的发育，除毛细血管外，其它血管壁形成分层结构，形成内膜、中膜、外膜；胚胎大动脉内皮细胞胞质内存在着丰富的粗面内质网和游离核糖体，代谢是很活跃的；大动脉管壁的内弹性膜形成较晚，先产生小片段，然后呈连续带状；大动脉内膜和中膜内不含典型的成纤维细胞，在中膜内存在一种能产生胶原纤维的细胞，其结构类似于平滑肌细胞。     

昆明小鼠早期胚胎体外发育阻滞原因分析

为了分析小鼠早期胚胎在体外发育阻滞的原因 ,建立早期胚胎体外培养系统 ,应用几种不同的培养系统对昆明小鼠单细胞胚胎在体外培养了 96～ 12 0 h。结果表明 ,小鼠单细胞胚胎在 M1 6 和 BWW培养液中卵裂均受到阻滞 ,且两者之间差异不显著 (P>0 .0 5 ) ;CZB和 HTF培养液能有效地克服小鼠胚胎的 2 -细胞发育阻滞 ,与 M1 6 和 BWW相比 ,2 -细胞卵裂率和囊胚率均存在显著性差异 (P<0 .0 1) ;在 M1 6 培养液中添加牛磺酸对早期胚胎发育有促进作用 (P<0 .0 1) ;小鼠早期胚胎在 CZB和牛输卵管上皮细胞 (COEC)共培养体系中的卵裂率较对照组明显提高 (P<0 .0 5 )     

羊体外胚胎高效生产技术研究现状

体外胚胎生产技术作为胚胎工程技术的基础,在提高繁殖潜力、加速良种繁育等多方面具有重要意义,包括卵母细胞采集、体外成熟、体外受精、体外胚胎培养等技术。文章主要介绍羊体外胚胎高效生产技术研究现状,分析卵母细胞体外成熟、体外受精、体外胚胎培养影响因素,并提出了羊卵泡的预测标记、卵母细胞新型质检手段、模拟羊体内环境的培养体系,以期为羊卵母细胞体外培养技术的研究及在胚胎高效生产中的应用提供参考。     

山羊孤雌胚胎的体外培养

系统地研究了培养液微滴的大小、培养液体系及血清浓度对山羊孤雌胚胎早期体外发育的影响。结果表明，培养液微滴以较大体积(200～500μL)的培养效果较好；在3种培养液中，添加10％的NGS对山羊孤雌胚胎的体外发育效果较好，囊胚率分别可达62．79％(81／129)、53．52％(38／71)、13．64％(12／88)；mCRlaa组囊胚发育率和囊胚细胞数显著低于SOFaa组和CRlaa组，SOFaa组优于CRlaa组，尽管SOFaa组和CRlaa组间无显著差异。在本试验条件下，以SOFaa培养液，山羊孤雌胚胎体外培养72h时加入10％的NGs，500μL微滴培养，其发育效果较好，囊胚率可达62．79％。     

活性氧对胚胎体外发育阻滞的影响

自由基是含有一个不成对电子的原子团.早在1931年,Michalis就提出某些酶促氧化还原反应的中间产物为自由基,其试验证据也表明,生物体内可能存在自由基,然而直到自由基生物学迅猛发展的最近30年,自由基在机体内的产生与清除才得以重视.现在,人们已经认识到自由基与许多疾病的发生和发展密切相关.自由基主要分为活性氧自由基和活性氮自由基.文章主要介绍活性氧自由基.     

山羊胚胎脊髓胶状质的形成和发育

对山羊胚胎脊髓胶状质发育的形态学变化了系统研究，结果表明：（1）山羊脊髓胶状质在胚胎第17周以后逐渐较多的神经元胞体和较大的淡染的神经元细胞核，提示胚胎第17周龄是山羊脊髓胶状质神经元发育的关键时期；（2）山羊脊髓胶状质内神经纤维在胚胎第11周时就已出现，而在髓神经纤维的髓鞘则在胚胎第15周时形成，以后逐渐发育成熟；（3）山羊脊髓胶状质的胶质细胞发育较早，在胚胎第6周末胶状质的胶质细胞发育较早，在胚胎第6周末胶状质原基刚形成时，胶质细胞核已经开始分化，到胚胎第18－19周时，胶质细胞又出现一个增殖高峰。     

用单胚mRNA差显技术克隆山羊早期胚胎发育相关基因

用单胚构建的mRNA差异显示技术，对体外培养的山羊早期2、4、8—16细胞期胚胎的基因表达进行了研究，并选择了一条在4细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明：该片段与牛胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）基因具有88％的同源性。该基因通过调控IGFs的生物学活性而影响早期胚胎的生长发育，并具有促进细胞分裂和影响内分泌的作用，是羊早期胚胎发育过程中的重要调控因素。     

山羊早期胚胎发育相关基因的克隆

用单胚构建的mRNA差异显示技术,对体外培养的山羊早期2、4、8～16细胞期胚胎的基因表达进行了研究,并筛选到了1条在8～16细胞期胚胎特异表达的条带进行分析。结果表明,该片段与犬细胞周期蛋白B3（CCNB3）基因具有82%的同源性。该基因作用和调控细胞的分裂活动,是羊早期胚胎发育过程中的重要影响因素。     

牛体外受精早期胚胎发育基因差异表达的研究

应用mRNA差异显示技术,对牛卵母细胞、体外培养的牛早期8细胞期和囊胚期胚胎的基因表达进行了研究。选取4条mRNA表达量存在差异的基因条带进行测序和同源性分析,并利用RT-PCR技术粗略检测其在卵母细胞、8细胞和囊胚中的表达水平。结果表明:4个基因分别与核糖体蛋白S4,Y连接1(RPS4Y1)、末端脱氧核苷酰转移酶作用因子2(DNTTIP2)、剪接和多聚腺苷酸化特异因子3(CPSF3)和转录因子AP-2γ(TFAP2C)高度同源。RPS4Y1、DNTTIP2、CPSF3和TFAP2C在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

KDM2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达分析

本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。     

Study on the Expression Profiles of A-FABP Gene in 5 Goat Breeds

In order to understand the regularities of A-FABP gene expression in Guizhou native goats,and to establish the theoretical basis of molecular marker assisted selection for meat quality traits,β-actin gene was used as control,expression levels of A-FABP gene in livers,kidneys,hearts,lungs,longissimus muscle,semimembranosus muscle and subcutaneous fat of Qiandongnan small Xiang goat,Guizhou White goat,Guizhou Black goat,Qianbei Ma goat and Nanjiang Yellow goat were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that A-FABP gene was expressed in all 7 tissues of 5 goat breeds,and the expression levels of A-FABP gene mRNA were all high in subcutaneous fat of 5 goat breeds;In subcutaneous fat,which was the main tissue of A-FABP gene expression in Guizhou native goats,and in longissimus muscle and semimembranosus muscle,which were directly associated with meat production property,A-FABP gene mRNA levels were all high in Qiandongnan small Xiang goat.The results suggested that the tissue distribution patterns of A-FABP gene mRNA in Guizhou native goat breeds were similar to each other.The excellent meat quality of Qiandongnan small Xiang goat might be related with the high expression levels of A-FABP gene mRNA in it's subcutaneous fat,longissimus muscle and semimembranosus muscle.     

5种山羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因的表达谱研究

为弄清贵州地方山羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,A-FABP)基因mRNA的表达规律,奠定肉质性状分子标记辅助选择的理论基础,试验以β-actin基因为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊共5个山羊品种心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌及皮下脂肪7个组织器官中A-FABP基因的表达.结果表明,5个山羊品种7个组织中都有A-FABP基因表达,且5个品种中皮下脂肪A-FABP基因的表达水平都较高;在贵州地方山羊A-FABP基因表达的最主要组织--皮下脂肪,以及在与产肉性能直接相关的组织--背最长肌和半膜肌中,黔东南小香羊A-FABP基因mRNA水平都较高.结果提示,贵州地方山羊A-FABP基因mRNA的组织分布模式相似,黔东南小香羊的优良肉质特性或许与其皮下脂肪、背最长肌和半膜肌中A-FABP基因的高表达有关.     

转EGFP基因山羊克隆胚的发育

利用脂质体包裹含EGFP基因的质粒,并将之导入山羊乳腺上皮细胞,经G418筛选获得阳性细胞,以阳性细胞作为核供体,利用核移植技术构建转基因克隆胚。结果表明：用转基因山羊乳腺上皮细胞作为核供体,电融合法更适合构建转基因克隆胚。转基因山羊克隆胚体外培养最佳方案是用SOFaa培养液,在培养72 h后加入10%的正常山羊血清（Normal goat serum,NGS）。荧光显微镜下观察到转基因克隆胚中EGFP的表达,大部分克隆胚发育到8-16细胞以后的时期,绿色荧光蛋白才开始逐渐表达,随着发育时间的延长,绿色荧光蛋白的表达也逐渐增强。说明外源基因在胚胎早期发育阶段可以表达,EGFP可以作为报告基因来实现对外源基因整合及表达的监测。     

Gene Expression Analysis on Different Muscles and Intramuscular Adipocytes in Cashmere Goat

The objective of this study was to discover the expression of key genes for fatty deposition in Inner Mongolia cashmere goat,so that deeply analysize the change features of intramuscular fat deposition.Real-time PCR was used to detect the expression pattern of seven different genes (PPARγ,FTO,Lipin,LPL,HSL,A-FABP and Perilipin) in ten different muscle tissues,and in intramuscular adipocyte for three periods as early (D3),middle (D7),and end (D11),as well as the changes in key points of induced differentiation time (24,48,72 and 96 h).The correlation between the seven genes and the intramuscular fat content was researched from the prospective of analyzing the tissues and cells.The results showed that FTO gene mRNA had a higher expression in different tissues than that of other genes.While the Lipin gene mRNA expression was the lowest than others,LPL and HSL were the key enzymes in the fat synthesis and splitting,the expression trends of which were basically similar,they only showed the opposite expression pattern in the psoas major muscle,and trapezius A-FABP and Perilipin gene expression patterns were more special,the overall expression level was lower,the former's expression level was higher in next moment chest muscle than other tissues,while the latter's expression level was higher in biceps femoris muscle than other tissues.Analyzing from the cell level,the expression patterns of Lipin,PPARγ,A-FABP and Perilipin were similar,with the increase of adipocytes cultivating day age and the triglyceride accumulation,the corresponding expression level increased gradually;The expression abundance of Lipin gene in each time point was extremely low;The expression level of HSL gene reduced gradually as the differentiation degree increases;The expression level of Perilipin gene was higher only in the late period of induction and differentiation.Through statistical analysis of the correlation,the PPARγ gene mRNA of cashmere goat formed negative correlation with intramuscular fat;While other adipogenic genes like HSL,LPL,FTO,Lipin,Perilipin and A-FABP mRNA formed positive correlation with intramuscular fat content.Therefore,the key gene expression of fat deposition had the specificity,generally,the amount of gene expression by quantitative analysis was FTO> PPARγ> LPL >HSL> A-FABP >Perilipin >Lipin,such results lay foundation for further researching the fat deposition mechanism and improving the quality of cashmere goat.     

绒山羊不同肌肉组织及肌内脂肪细胞的基因表达分析

试验旨在研究脂肪沉积关键基因在内蒙古白绒山羊的表达规律,以期深入分析绒山羊肌内脂肪沉积特征.利用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ、FTO、Lipin、LPL、HSL、A-FABP和Perilipin7个基因在绒山羊10个不同肌肉组织及肌内前体脂肪细胞分化的3个时期(早期(D3)、中期(D7)、末期(D11))、诱导分化关键时间点(24、48、72和96 h)的变化,分别从组织和细胞角度对其进行分析,并研究其与肌内脂肪含量的关系.结果表明,FTO基因的表达水平高于其他基因;Lipin基因的表达量最低;LPL和HSL是脂肪合成和分解的关键酶类,其表达趋势大致相同,仅仅在腰大肌和斜方肌这两个部位的表达模式相反.A-FABP和Perilipin基因表达模式也较为特殊,整体表达量较低,前者仅仅在胸下矩肌中有较高表达,后者在股二头肌中有较高表达.从细胞水平分析发现Lipin、PPARγ、A-FABP和Perilipin的表达模式相似,随着前体脂肪细胞培养日龄的增加和甘油三酯的积聚,其表达量逐渐升高;Lipin基因在各个时间点的表达丰度极低;HSL基因的表达量随分化程度的升高而逐渐降低;Perilipin基因仅仅在诱导分化的后期有较高表达.相关性统计分析发现,PPARγ基因mRNA与肌内脂肪多呈负相关;而其他成脂基因HSL、LPL、FTO、Lipin、Perilipin、A-FABP mRNA与肌内脂肪含量多呈正相关.因此,脂肪沉积关键基因的表达具有特异性,总体上看基因表达量为FTO> PPARγ> LPL >HSL> A-FABP >Perilipin >Lipin,该结果为进一步研究脂肪沉积机制及优化山羊肉品质奠定基础.