大黄鱼♀与黄姑鱼♂杂交F1家系初孵仔鱼的AFLP分析

为了评估大黄鱼♀与黄姑鱼♂杂交F₁在良种培育与遗传学研究中的应用潜力,利用AFLP标记研究了双亲基因在2个杂交F₁家系(HF1和HF2)初孵仔鱼中的传递和分离方式。8对AFLP选择性扩增引物在两对亲本中分别检出478和446个片段。在HF1中,检出片段包括215条母本特异条带(FSB)、165条父本特异条带(MSB)和98条双亲共有条带(MuB),其中,121条(56.3%)FSB、115条(69.7%)MSB和93条(94.9%)MuB传递给了全部后代,其余片段在后代中发生分离。FSB和MSB分离位点的平均显性表型频率之间没有显著性差异。AFLP标记在HF2的传递与分离和HF1相似,只是分离位点的比例较HF1低,而且检出了2个非亲位点。此外,在HF1和HF2中都出现了较高比例的偏离孟德尔定律的分离位点。这些结果表明,大黄鱼♀×黄姑鱼♂杂交F₁初孵仔鱼中同时含有来自双亲的基因;虽然计算结果显示杂交F₁在遗传上略偏向于母本,但是父源基因和母源基因没有明显的选择性丢失;母本特异位点多态比例与大黄鱼种内杂交F₁相当。研究结果为大黄鱼♀×黄姑鱼♂杂交F₁的开发与管理提供了科学依据。     

大鲵皮肤cDNA文库ESTs分析及Dynll 2基因的分离与表达

以本实验室构建的大鲵皮肤cDNA文库为材料,通过文库质量检测、随机测序、ESTs拼接、COG软件进行基因注释等对文库进行了分析,并从中分离获得了大鲵胞质动力蛋白轻链2(dynein light chain,LC8-type 2,Dynll 2)基因的cDNA序列,对Dynll 2基因进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,本实验室构建的大鲵cDNA文库初级库容为1.50×10⁶ cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。400个随机克隆测序共获得343个有效ESTs,其中214条ESTs序列E值＜10^-6,经COG软件归为9大类,其中与分泌蛋白、细胞代谢、细胞骨架以及信号转导相关的基因表达量最高,分别为31.3%、14.0%、13.0%和12.6%。表明大鲵皮肤分泌活动强烈,代谢旺盛,这和大鲵皮肤发挥免疫、呼吸以及渗透压平衡等生理功能相一致。获得的大鲵Dynll 2基因全长为682 bp,其中5′-UTR为57 bp,3′-UTR为313 bp,生物信息学分析表明,该基因编码104个氨基酸,分子量为12.03 ku,等电点pI值为7.05。Dynll 2蛋白在88~104处有由里向外和由外向里的2个跨膜螺旋区,且二级结构以α—螺旋为主;在69~87处有典型的“ZnFC2H2”结构模体;经比较,其三级结构与鼠Dynll 2蛋白相似。Dynll 2蛋白的进化分析表明,大鲵与无尾两栖类相比,更接近陆生动物。荧光定量实验表明,大鲵Dynll 2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。     

基于RAG2基因序列分析仿石鲈科鱼类及其相关种类系统进化关系

为探讨仿石鲈科鱼类目前存在的分类争议问题,测定了仿石鲈科(Haemulidae),金线鱼科(Nemipteridae),眶棘鲈属(Scolopsis)等相关科属共33种鱼类RAG2基因部分序列,利用最大简约法(MP法)和贝叶斯分析法(BI法),并以黄鹦嘴鱼作为外类群构建分子系统进化树.结果显示,33种鱼类共形成三大类群,其中仿石鲈科8个属聚成一类群,金线鱼属和眶棘鲈属的种类聚成另一类群,眶棘鲈属未能与仿石鲈科形成单系.同时,基于属间遗传距离比较,眶棘鲈属与金线鱼科的遗传距离比其与仿石鲈科各属的遗传距离要小得多,表明眶棘鲈属与金线鱼科有更近的亲缘关系,支持眶棘鲈属隶属于金线鱼科的观点.此外,传统分类资料中归类于仿石鲈科的髭鲷属(Hapalogenys)也没有与仿石鲈科聚成单系,而是独自形成一支,位于进化树基部,显示出髭鲷属与仿石鲈科关系较远,与近年来认为髭鲷属应该从仿石鲈科中划分出去的结果一致.在仿石鲈科内部,少棘胡椒鲷属(Diagramma)中的少棘胡椒鲷与胡椒鲷属(Plectorhinchus)的种类关系很近.在进化树上,少棘胡椒鲷位于胡椒鲷属的内部,花尾胡椒鲷最先分化出来,位于该分支基部,支持少棘胡椒鲷归为胡椒鲷属,名称沿用原来的学名胡椒鲷的观点.     

溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK鉴定

哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群,包括溶藻弧菌在内的6个种在表型和遗传型上均十分相似,要准确鉴定各种有一定难度。看家基因的研究及生化鉴定系统的出现为弧菌鉴定提供了多种方法,本文比较了16S rRNA基因、toxR基因和pyrH基因以及VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。哈维群弧菌基因组内16S rRNA基因是多拷贝的,且拷贝间序列差异大于种间差异,不适用于种的鉴定。单拷贝基因toxR和pyrH序列种内差异均小于种间差异。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种;toxR基因系统发育学分析也显示,哈维群弧菌各种独立地聚类分支,且溶藻弧菌种内存在两个明显的聚类分支,说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到类似的结果,但pyrH基因具有较强的保守性,因而分辨力稍低于toxR基因。VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率,且鉴定谱较窄。因此,建议在实际应用中采用toxR基因比对作为溶藻弧菌快速鉴定的主要手段,可再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。     

条斑紫菜6个品系的SRAP分析

为鉴别条斑紫菜不同品系的种质,使用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记对条斑紫菜的5个选育品系和1个野生品系进行遗传分析,结果从35对引物组合中筛选出可扩增出稳定清晰条带的组合11对,共获得131个扩增位点,其中多态性位点125个,多态性比例高达95.42%。6个品系 间的遗传距离为0.364 3～0.867 9,平均为0.593 0。用UPGMA法进行聚类分析,结果将6个品系分为2个群,所反映的亲缘关系与各品系的来源基本一致,说明SRAP 标记技术可以成为条斑紫菜品系间遗传分析的有效工具。在131个多态性位点中,选择扩增出的4个位点构建了6个品系的指纹图谱。另外,通过ME1/EM6引物组合 扩增得到耐高温品系TM-18的特异性条带,经回收测序和重新设计引物,该条带在其丝状体和叶状体DNA中均能稳定地被扩增出来,可用于该品系的种质鉴别 。     

基于线粒体COⅠ和Cytb基因序列的北太平洋柔鱼种群遗传结构研究

为准确掌握柔鱼的种群遗传结构,拟通过线粒体DNA的COI和Cytb基因序列分析方法对柔鱼不同产卵季节群体的遗传多样性和遗传结构进行研究。经PCR扩增与测序分别获得600 bp COI与481 bp Cytb基因序列。基于COI基因序列分析得到的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数及平均核苷酸差异数分别为24、(0.729 ±0.033)、(0.005 70 ± 0.003 25)和3.421。基于Cytb基因序列分析得到的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数及平均核苷酸差异数分别为28、(0.852 ± 0.016)、(0.006 45 ± 0.003 73)和3.101。分析认为, 北太平洋柔鱼2个产卵季节群体均具有较高的单倍型多样性指数和较低的核苷酸多样性指数。单倍型邻接树、两两群体间的F_st值以及AMOVA分析结果均表明, 北太平洋柔鱼2个产卵季节群体间的遗传差异不显著, 不存在显著的群体遗传结构。初步认为, 该海域因缺乏地理上的障碍, 加之北太平洋海流的作用以及柔鱼个体较强的游泳能力, 使得群体之间具有较强的基因流。     

栉孔扇贝Dmrt1的分子鉴定及表达模式分析

DMRT1是DMRT家族重要成员之一,主要参与动物性别决定和分化调控,但在不同动物中其表达和功能调控作用存在差异。本研究采用生物信息学方法分析了栉孔扇贝（Chlamys farreri）Dmrt1的序列特征,采用半定量RT-PCR技术确定了其mRNA在成体性腺、闭壳肌、外套膜、鳃和肾等组织中的分布,定量RT-PCR和原位杂交技术揭示了Dmrt1 mRNA在性腺中的时空表达特征。结果显示：栉孔扇贝Dmrt1序列中含有DMRT家族保守的DM结构域;其mRNA仅在栉孔扇贝性腺中表达,在精巢中的表达明显高于卵巢,并且以生长期精巢的表达水平最高;原位杂交检测Dmrt1阳性信号主要定位于生殖细胞的细胞质中。研究结果表明,Dmrt1在栉孔扇贝性腺中的表达特征与大部分动物性腺中的表达特征基本一致,推测其可能参与性别分化和精巢发育的功能调节。     

大鲵Dmrt2基因cDNA的克隆与表达分析

Dmrt2是参与性腺发育最古老的发育基因家族Dmrt家族成员之一,在维持胚胎组织的正常发育、精子的发生、神经系统和感觉器官发育等方面起重要作用。目前在哺乳动物人类、鸟类红原鸡以及水生动物青鳉中都克隆到Dmrt家族成员并证明其与性腺和生长发育的密切相关性。研究采用RACE方法克隆了大鲵Dmrt2基因全长cDNA序列共2 026 bp,开放阅读框长1 581 bp,5′非编码区长58 bp,3′非编码区长387 bp,基因序列提交GenBank的登录号为FJ859987。该基因编码蛋白含526个氨基酸,依生物信息学方法预测该氨基酸为非跨膜蛋白,无信号肽,定位在细胞质内,无分泌蛋白。CDD数据库分析该ORF框翻译的氨基酸,在93~146位含DM保守结构域(c102557)的两个成员pfam00751和smart003010,与哺乳类人mab-3、鸟类红原鸡Dmrt2、两栖类非洲爪蟾Dmrt2和水生类鲐mab-3 DM结构域存在I(异亮氨酸)、R(精氨酸)、M(甲硫氨酸)、T(苏氨酸)、C(半胱氨酸)5个氨基酸的变异;系统进化树分析表明:大鲵Dmrt2与以上四物种首先聚类,据此推测Dmrt基因在进化上高度保守,DM结构域上5个氨基酸的变异对蛋白功能的发挥可能无重要影响。实时荧光定量组织差异表达显示,Dmrt2基因在大鲵的精巢和肌肉组织中高表达,预示该基因可能在性腺发育和生长发育方面起重要作用。     

DNA 条形码在鲱形目鱼类物种鉴定和系统进化分析中的应用

采用PCR特异性扩增获得中国近海鲱形目(Clupeiformes)2科6属7种的48条线粒体COI基因序列,结合从Gen Bank筛选出的4科40属83种的COI基因序列225条,对鲱形目鱼类的COI条形码基因特征、种内与种间遗传距离及其分子系统进化关系进行了分析,探索了DNA条形码技术在辅助鱼类物种鉴定和分类中的适应性。结果表明,4科41属90种273条COI基因序列的平均碱基组成为T:28.3%、C:28.3%、A:24.2%、G:19.2%,碱基组成表现出明显偏倚性。鲱形目鱼类种间的平均遗传距离为0.131,种内平均遗传距离为0.003,种间距离为种内距离的41倍;系统学分析结果显示,97.8%的鱼类在系统进化树上均为单系。可见,鲱形目鱼类DNA条形码符合物种鉴定的要求,且基于COI基因所建的NJ树对物种分类具有较为准确的辨识力。系统进化分析结果表明,COI基因不仅能够解决低阶分类单元的系统进化关系,对于高阶分类单元的系统分析研究结果也有一定参考价值。     

中华绒螯蟹长江、黄河和辽河水系野生和养殖群体的遗传多样性

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是中国最重要的淡水养殖蟹类,广泛分布于东亚地区,养殖区域主要集中在长江、黄河和辽河流域。本研究基于线粒体DNAD-loop区评估辽河野生群体(LW)和养殖群体(LC)、黄河野生群体(HW)和养殖群体(HC)及长江野生群体(YW)和养殖群体(YC)的遗传多样性和种群结构。结果显示:(1)用于本研究的D-loop基因片段长度为477 bp,共包含234个变异位点和131个简约信息位点, 6个群体的262个个体中共有110个单倍型,包括90个独有单倍型和20个共享单倍型;(2)6个种群的单倍型多样性指数(Hd)范围为0.88889～0.96522,核苷酸多样性指数(π)范围为0.00887～0.01602,养殖和野生群体遗传多样性水平依次为:HCYCLC及HWLWYW;(3)6个群体的遗传距离(Da)范围为0.0119～0.0173,不论是养殖群体还是野生群体,辽河群体和长江群体之间的遗传距离均最小,且6个群体间遗传分化指数FST为0.12938。对6个群体进行中性检验显示Tajima’s D和Fu’s Fs的值均为负值。综上,基于线粒体D-loop基因的研究结果表明,三水系养殖和野生群体均具有较高的遗传多样性,且辽河和长江水系中华绒螯蟹的亲缘关系相对较近,该研究为中华绒螯蟹的种质资源评估、保护和开发提供了参考。     

于线粒体COI基因的6个黄鳝群体遗传多样性

为研究我国主要养殖区域黄鳝（Monopterus albus）的遗传多样性,利用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome C oxidase subunit I,COI）基因对来源于湖北、江西、安徽、湖南、重庆和山东的6个黄鳝群体共187个样本进行遗传多样性分析。结果表明长度为646 bp的COI基因序列在6个群体的碱基含量基本相同,碱基T、C、A和G的平均含量分别为27.7%,30.7%,24.5%和17.1%,包括61个变异位点,其中单位点突变16个,简约信息位点45个,变异位点以C/T间的转换为主。6个群体中共检测到38种单倍型,单倍型多样性（H_d）为0.886,核苷酸多样性（π）为0.01094,群体整体遗传多样性高,湖北和山东群体遗传多样性都较高（H_d>0.8）,湖南群体和江西群体的遗传多样性次之（H_d>0.5）,而安徽和重庆两个群体的遗传多样性都较低（H_d<0.5）。6个群体间有显著的遗传分化,基因交流贫乏（N_m<1）。群体分子变异分析（AMOVA）显示,6个黄鳝地理种群群体内的遗传变异高于群体间的遗传变异,其遗传变异主要发生在群体内部。遗传结构和系统发育树显示湖南群体与其他5个群体的遗传关系较远。重庆群体可能由单一或很少几个群体进化而来的,起源比较单一。就目前而言,黄鳝野生种质资源遗传多样性丰富,苗种频繁流动和人工养殖尚未对其种群结构造成较大影响,仍有较强的环境适应能力和良好的育种潜力。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。