阿留申病毒大连株非结构蛋白基因的克隆与序列分析

根据Genbank上发表的水貂阿留申病毒基因序列数据,设计了3对引物,采用PCR的方法分别对ADV-DL1、ADV-DL2株非结构蛋白基因进行扩增,将各片断克隆至pMD18-T载体,经PCR鉴定后进行了序列测定和分析。结果显示,ADV-DL1、ADV-DL2与GenBank上公布的ADV毒株相比,核苷酸序列同源率NS1为85.9%~90.0%,NS2为85.1%~92.7%,NS3为83.0%~95.1%。ADV-DL1与ADV-DL2同源率NS1为93.7%,NS2为95.6%,NS3为98.5%。氨基酸同源率NS1为82.8%~85.8%,NS2为80.7%~92.1%,NS3为72.9%~95.4%。ADV-DL1与ADV-DL2同源率NS1为90.3%,NS2为92.1%,NS3为95.4%。     

水貂阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

本研究利用PCR方法从水貂阿留申病毒相关病料中扩增出VP2蛋白部分基因,并进行原核表达,成功获得VP2重组蛋白;利用纯化的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,成功获得3株杂交瘤细胞:1F4F7D9、3E9G3D4和4B8B3F8;分别接种小鼠,间接ELISA检测结果表明,3组实验小鼠腹水的单克隆抗体效价均在106以上。     

番鸭源小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的结构蛋白及其抗原性

应用交叉免疫印迹方法,分析比较了番鸭源小鹅瘟病毒(MDGPV)和番鸭细小病毒(MDPV)结构蛋白抗原性的差异.结果表明:MDGPV和MDPV纯化病毒在SDS-PAGE分析中均呈现3种结构蛋白,分子质量分别为81、65和55 ku;在免疫印迹试验中,MDGPV和MDPV的VP1、VP2和VP3三种结构蛋白均可被同源抗血清识别,而异源抗血清均不能识别VP1蛋白;免疫番鸭血清和感染耐过番鸭血清识别的条带无明显区别.可见,MDGPV和MDPV的抗原性差异主要体现在VP1蛋白上.     

一株水貂阿留申病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了对水貂阿留申病毒的诊断防治提供依据,验证水貂阿留申病毒在我国的遗传演化情况,研究了阿留申病毒的诊断抗原。将疑似阿留申病毒感染致死的送检水貂进行PCR初步诊断,并应用猫肾传代细胞系(CRFK)进行了分离培养。提取细胞培养物的DNA,经PCR检测呈阳性后,对分离前后的阿留申病毒VP2基因全序列进行克隆测序,其结果与GenBank上传的其它ADV亚型VP2序列进行了比较后证明:获得了一株可以在CRFK细胞中稳定生长的水貂阿留申病毒毒株(命名为ADV-ZYL1)。氨基酸分析发现,ADV-ZYL1毒株与美国强毒力毒株ADV-Utah-1的氨基酸同源性最高,为96.1%,与ADV-Far East的氨基酸同源性为92.7%,表明ADV-ZYL1的VP2蛋白氨基酸存在很高的突变率。     

细小病毒非结构蛋白NS1功能的研究进展

介绍了细小病毒非结构蛋白NS1的生化特性,综述了近年来NS1蛋白与病毒复制、宿主细胞凋亡之间以及与基因表达调控之间的关系,并对NS1蛋白的进一步研究提出了建议。     

水貂肠炎病毒B株全基因克隆与序列分析

将水貂肠炎病毒基因组分4个重叠片段进行PCR扩增,并将产物克隆到pMD18-T载体中,测定基因组近全长序列。其中编码水貂肠炎病毒非结构蛋白基因(NS1基因)全长为2 007 bp,编码668个氨基酸;编码结构蛋白基因(VP2基因)全长为1 755 bp,编码584个氨基酸。序列分析结果表明:水貂肠炎病毒B株与犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒NS1序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.8%～99.2%和98.8%～99.2%,与其他细小病毒毒株VP2序列之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.5%～99.8%和97.8%～99.5%,与MEVantigenic type 2株在亲缘上有着最密切关系。     

水貂肠炎细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析

对水貂肠炎细小病毒SMPV-11株结构蛋白VP2基因进行扩增,获得了基因序列全长为1755bp的SMPV-11株VP2基因,其编码584个氨基酸;应用DNAStar分析软件对该序列进行同源性分析发现,SMPV-11株VP2基因与其他6株水貂肠炎细小病毒株核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为99.2%～99.4%和98.6%～99.1%,与猫泛白细胞减少症病毒标准株CU-4株同源性为99.3%和99.1%,系统发生树分析表明它们属于同一个分支。本研究为水貂肠炎细小病毒分子流行病学调查和新型疫苗的研究奠定基础。     

禽流感病毒基因组及其编码蛋白的结构与功能

禽流感病毒为单股负链RNA,分为8个独立的节段,分别编码聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)等10种蛋白质,为了深入认识该病毒,对其基因组及各种编码蛋白的结构和功能进行了综述。     

水貂阿留申病毒部分VP2基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列设计合成1对特异引物,利用PCR方法扩增ADV国内分离株部分VP2基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a中.经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2.阳性重组质粒转化宿主菌BL21,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明蛋白获得了表达,表达产物的分子质量为21 kD,与理论推测的分子质量一致;在终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下,5 h时表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗水貂抗体所识别,具有相应的抗原性.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测李

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

猪细小病毒NS1基因和VP2基因的克隆与序列分析

根据GeneBank 上发表的猪细小病毒(PPV)的基因组序列,分别设计扩增非结构蛋白NS1基因和结构蛋白VP2基因的特异性引物,采用PCR方法扩增PPV泰安株(PPV-TA)NS1基因和VP2基因.结果表明,PPV-TA NS1基因长1989 bp,编码662个氨基酸,与参考PPV NS1基因核苷酸同源性在98.3 %～99.9 %之间.PPV-TA NS1蛋白有3个糖基化位点分别是356NIS、446NFS、513NLT,除PPV Tomau/1/02在356位缺失了一个糖基化位点之外,PPV-TA与其他PPV参考毒株一致;这表明不同毒株NS1蛋白调节功能可能有差异.PPV-TA NS1蛋白的潜在磷酸化位点是Thr435和Ser473,与PPV参考毒株相同.NS1基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV china亲缘关系最近.PPV-TA VP2基因长1740 bp,编码579个氨基酸,与PPV参考毒株VP2基因核苷酸同源性在98.3 %～99.8 %之间.PPV-TA VP2蛋白的378D、383H、436S氨基酸残基决定了PPV的组织嗜性,与PPV-NADL-2和PPV-china相同,这表明这3个毒株的组织嗜性是一致的.但与其他PPV参考毒株有差异,这表明不同毒株在动物体内的组织分布是有差别的.PPV-TA VP2蛋白有9个线性抗原位点,与PPV NADL-2和PPV china的线性抗原位点是一致的,这表明具有相同的抗原特性.VP2基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV NADL-2亲缘关系较近.     

PRRSV 的病毒蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的病毒性疾病,给世界养猪业造成了极大的威胁.从猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组、非结构蛋白和结构蛋白3个方面对PRRSV的病毒蛋白研究进展进行综述.     

疱疹病毒衣壳蛋白及其组装研究进展

疱疹病毒衣壳主要由VP5蛋白构成,还包括其它3种含量相对较少的蛋白,VP19C,VP23,VP26。VP5是所有162个衣壳粒的结构亚单位,而VP19C和VP23则位于衣壳粒的空隙间。除了结构蛋白之外,衣壳的组装还涉及蛋白酶和脚手架蛋白preVP22a的参与。冷冻电镜与重组杆状病毒技术的应用使得疱疹病毒衣壳的研究取得重要进展,前者确认了衣壳的形态结构,后者通过证实完整衣壳组装过程中的中间体来确认了组装路径。本文综述了当前疱疹病毒衣壳蛋白及其组装的研究进展。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础.[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒.[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右.FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构.[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率.     

家蚕感染质型多角体病毒（BmCPV）后中肠组织 差异蛋白质分析

【目的】分析家蚕感染质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）后中肠组织中蛋白质的差异表达,为从蛋白质分子水平上探索家蚕感染BmCPV后的分子应答机制奠定基础。【方法】通过蛋白质双向凝胶电泳技术（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE）对BmCPV病毒感染组和灭菌水对照组家蚕p50的中肠组织蛋白进行比较,通过基质辅助质量飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）和家蚕蛋白质数据库检索对所得到的差异蛋白点进行鉴定与分析。【结果】2-DE电泳结果比较分析表明,BmCPV感染组和对照组家蚕的中肠组织有8个差异蛋白斑点,其中对照中肠有3个,感染中肠有5个。经MALDI-TOF MS鉴定结果显示对照家蚕中肠中的3个差异蛋白斑点分别为家蚕的类固醇脱氢酶（Hydroxysteroid dehydrogenase）、线粒体电压依赖的阴离子通道孔蛋白（Voltage-dependent anion-selective channel,VDAC）和1个未知新型蛋白;感染家蚕中肠的5个差异蛋白点分别是家蚕的Ras-鸟嘌呤核苷酸释放因子1（Ras-specific guanine nucleotide- releasing factor 1-like,RASGRF1）、H+转运ATP合成酶亚基、候选肿瘤抑制因子（Putative tumor suppressor protein,PDSS2）、多药耐药蛋白（Multidrug resistance-associated protein,MRP4/ABCC4）、冻坏B样蛋白（Nipped-B-like protein- like,NIPBL）。【结论】BmCPV感染可导致家蚕中肠组织多种蛋白的差异表达,提示家蚕可能通过启动不同的机制来应答病毒的感染,其中VDAC的下调表达以及PDSS2、MRP4/ABCC4和NIPBL的上调表达均与诱导细胞凋亡相关,推测家蚕在BmCPV感染的过程中可能启动了细胞凋亡的抗病毒机制。     

The atomic structure of Mengo virus at 3.0 A resolution

The structure of Mengo virus, a representative member of the cardio picornaviruses, is substantially different from the structures of rhino- and polioviruses. The structure of Mengo virus was solved with the use of human rhinovirus 14 as an 8 A resolution structural approximation. Phase information was then extended to 3 A resolution by use of the icosahedral symmetry. This procedure gives promise that many other virus structures also can be determined without the use of the isomorphous replacement technique. Although the organization of the major capsid proteins VP1, VP2, and VP3 of Mengo virus is essentially the same as in rhino- and polioviruses, large insertions and deletions, mostly in VP1, radically alter the surface features. In particular, the putative receptor binding "canyon" of human rhinovirus 14 becomes a deep "pit" in Mengo virus because of polypeptide insertions in VP1 that fill part of the canyon. The minor capsid peptide, VP4, is completely internal in Mengo virus, but its association with the other capsid proteins is substantially different from that in rhino- or poliovirus. However, its carboxyl terminus is located at a position similar to that in human rhinovirus 14 and poliovirus, suggesting the same autocatalytic cleavage of VP0 to VP4 and VP2 takes place during assembly in all these picornaviruses.     

σNS蛋白与宿主TRAM1因子互作对鸭呼肠孤病毒复制的影响

宿主因子TRAM1(translocation-associated membrane protein 1,TRAM1)是一种参与I型膜蛋白质分解的蛋白,通过升高含量来缓解内质网(ER)在应激时的压力。前期研究发现,鸭呼肠孤病毒(duck reovirus,DRV)感染原代鸭成纤维细胞后,TRAM1宿主因子变化异常。为确定宿主细胞TRAM1因子与DRV非结构蛋白σNS是否存在相互作用以及相互作用对DRV复制的影响,本实验首先表达σNS蛋白,通过GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)发现TRAM1蛋白与σNS蛋白在细胞外存在相互作用;通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)试验证实二者在细胞内存在相互作用。过表达TRAM1能够从转录水平抑制DRV σNS的表达,而抑制TRAM1提高σNS的转录水平。本研究为进一步分析σNS蛋白在DRV复制过程中的功能以及为σNS蛋白与宿主因子TRAM1互作对DRV复制的影响提供试验依据。