绿色荧光蛋白“转基因”猪问世

曾培育出我国首例成体体细胞“克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，于2006年12月22日又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国、日本之后第四例绿色荧光蛋白转基因猪。     

我国首例绿色荧光转基因克隆猪成功产崽

本刊讯 从东北农业大学获悉,我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪日前成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。有关专家称,这次试验的成功标志着我国通过体细胞核移植技术生产转基因猪已经发展成熟。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

黑龙江省科技进步一等奖 东北民猪体细胞核移植及绿色荧光蛋白转基因猪研究

<正>主要研究内容包括:1、猪卵母细胞体外成熟培养体系;2、东北民猪、大白猪和哈白猪体细胞采集培养和冷冻保存;3、绿色荧光蛋白基因转染体细胞及筛选:4、体细胞核移植胚胎的构建和体外发育;5、绿色荧光蛋白转基因阳性细胞核移植、体外胚胎发育以及外源基因表达检测;6、受体猪选择、移植前处理、胚胎移植及妊娠受体猪管理。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

我国学者培育出可同时表达4种荧光蛋白的克隆猪

据悉,在中科院广州生物医药与健康研究院成功培育出了一种特殊的转基因克隆猪,这种克隆猪在特定波长的激发光下可分别发出红、黄、绿、青4种荧光,这是国际上首次获得能够同时表达4种荧光蛋白的转基因克隆猪。研究组通过电穿孔的方法分别将红色、黄色荧光蛋白、绿色以及青色荧光蛋白的4种基因同时转入长白猪胎儿成纤维细胞,然后进行体细胞克...     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

表达绿色荧光蛋白的猪胚胎生殖细胞分离

以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体，对处于快速增殖期的8株猪胚胎生殖(EG)细胞(4—9代)进行转基因试验。用1μg DNA和2μL LipofecTamine 2000转染EG细胞后，共获得4株转染EGFP基因的EG细胞系(EG—EGFP)，可发出强绿色荧光；EG—EGFP细胞连续培养2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG—EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中，共注射135枚胚胎，其中112枚存活并发育至囊胚(83．0％)；86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞，其中57枚囊胚在内细胞团(ICM)上发现有EG—EGFP细胞。     

人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。     

《农村科学实验》杂志广告价目表

韩国研究机构首次培育成功转基因荧光鸡，使转基因鸡蛋在食品、制药等领域的大规模应用更前进了一步。 大邱基督教大学医学院教授金泰完，近日宣布了这一成果。转基因荧光鸡的体内植入了水母的绿色荧光蛋白（GFP），在普通光线下与其它鸡无异，在紫外线照射下，嘴和羽毛发出明亮的绿色荧光。     

绿色荧光蛋白基因在水稻遗传转化中的应用

本研究构建了含有编码绿色荧光蛋白基因的植物表达载体,以愈伤组织作为外植体,采用农杆菌介导法将携带绿色荧光蛋白的植物表达载体转入水稻品种秀水11中.分析了转化1个月的抗性愈伤组织以及2个月的转基因植株根中绿色荧光蛋白基因的表达.在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达,转基因水稻愈伤组织和根具有很高的绿色荧光信号.结果表明,在水稻遗传转化研究中,绿色荧光蛋白基因既可用于检测基因的瞬间表达,也可用于检测基因在细胞中的稳定表达.     

科技前沿

宁夏在高盐碱水域人工繁育鱼苗成功，新转基因玉米富含三种维他命，我科学家培育出含油量达60％的油菜籽，新生物燃料实验室：从“一包”变为“一桶”，H本研发新品种“发芽蔬菜”，试验表明转基因玉米对牛奶生产没有影响，美洲正研究用于抵抗破坏作物的线虫的细菌，首例栽培种落花生SSR图谱发布。     

转基因猪研究的回顾及今后发展方略之我见

简要回顾了20多年来国内外转基因猪的研究,在对猪生产性能的遗传改良、用猪作为生物反应器生产医用蛋白以及用猪作为异种器官移植的供者等方面．取得的一些重要进展：概述了原核注射法、精子介导法、逆转录病毒感染法和体细胞核移植法转基因技术的建立和发展历程：对转基因猪的遗传稳定性进行了讨论。并根据国内外发展的态势和我国养猪业的现状．提出了转基因猪研究方向和技术路线的发展方略．     

微卫星DNA对外源基因遗传的影响

试验通过转绵羊金属硫蛋白启动子-猪生长激素(oMT-pGH)基因和转绵羊金属硫蛋白启动子-猪生长激素-微卫星DNA(oMT-pGH-microsatellite DNA)基因猪的连续传代.分析了后代中转基因阳性猪的比例,并比较了两种转基因猪的遗传效果.结果发现,外源基因的传代不稳定.世代中转基因个体的比例在逐代降低;Microsatellite DNA片段在转基因猪的传代中没能显现出提高整合率的作用.     

复制缺陷型慢病毒载体法高效制作转基因家禽

基于慢病毒的第三代复制缺陷型载体由于可侵染分化及未分化细胞，在细胞增殖、分化中没有转录沉默现象，且高效整合，具有高安全性，因而倍受关注。在我们以绿色荧光蛋白（GFP）为标记基因，用慢病毒载体制作转基因鸡，PCR检测显示有67%的个体为转基因阳性，其中2只可从活体体表直接发现较强的绿色荧光信号。     

农业信息

农业信息我国培育出首批基因猪一种生长快、耗料低、肉质好、抗病力强的转基因猪，已由湖北农科院畜牧研究所培育成功。这项国家“８６３”高科技成果，不久前已在武汉通过专家鉴定。该所魏信庆副研究员从１９８９年开始此项工作，以猪为研究对象，采用猪基因导入技术，先...     

我国完成世界首例转基因克隆兔实验

本刊讯 我国完成的世界首例转基因克隆兔到目前已存活3个多月。日前在上海通过分子生物学鉴定，结果显示，实验兔含有外源的绿色荧光蛋白基因，证明其为转基因克隆兔。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵研究

[目的]为建立稳定、高效的绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵技术提供依据。[方法]将30只5~8周龄的绿色荧光蛋白转基因小鼠随机平均分成3组,分别腹腔注射5、7.5、10 IU的PMSG,48 h后腹腔注射7.5 IU的HCG,比较不同剂量PMSG对绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵效果的影响。[结果]PMSG剂量为7.5 IU处理组获得的胚胎数明显高于PMSG剂量为5、10 IU处理组,且差异显著(P<0.05)。PMSG剂量为5、7.5、10 IU处理组的小鼠见栓率分别为70%、80%、90%,处理间差异不显著(P>0.05)。随着PMSG剂量的加大,小鼠的子宫充血程度和卵巢体积逐渐增大。[结论]绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵技术中所用PMSG的最佳剂量为7.5 IU。     

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。