Oct4,Sox2,Nanog和c-Myc基因在蚯蚓发育早期的表达

通过已知物种的干细胞多能性基因核酸序列,利用同源序列法,成功克隆得到赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)的Oct4,Nanog,Sox2和c-Myc 4个基因,并通过实时荧光定量PCR分析了上述4个基因在赤子爱胜蚓茧孵化期间的表达情况。结果表明:赤子爱胜蚓茧在孵化期0~21 d,4个基因呈相似的规律,表达量均逐步升高,在21 d达到峰值;在幼虫期Oct4,Nanog和c-Myc 3个基因的表达量高于孵化期。结果表明,上述基因在赤子爱胜蚓早期发育过程中表达模式具有一定的相似性。     

Oct4和Sox2在食管鳞癌组织中的表达及相关性探讨

目的探讨Oct4和Sox2在食管鳞癌组织中的表达及二者之间的相关性。方法应用免疫组化SP法和流式细胞术检测98例食管鳞癌标本及43例正常食管黏膜组织中Oct4和Sox2的表达情况,分析其与各临床病理特征的关系及二者之间的相关性。结果食管鳞癌组织Oct4和Sox2的阳性表达率均高于正常组织(P0.05);流式细胞术结果显示,癌组织中Oct4和Sox2的蛋白相对含量也明显高于正常组织(P0.05)。随着分化程度的降低,Oct4和Sox2的表达明显升高,即二者与食管癌组织的分化程度呈负相关(P0.05),且Oct4和Sox2的表达与TNM分期、有无外膜浸润明显相关(P0.05),而与患者年龄、性别无关。食管鳞癌组织中Oct4和Sox2表达呈正相关(r=0.295,P=0.003)。结论 Oct4和Sox2在食管鳞癌的发生、发展过程中起重要作用,有望成为食管癌生物治疗的新靶点。     

小鼠早期胚胎细胞膜电位的测定及胚胎早期分化诱因的探讨

目的:调查早期胚胎细胞分化的诱因。方法:使用Patch clamp7型膜电位测定仪,测定ICR小鼠4、8、16、32细胞期胚胎的细胞膜电位。结果:①细胞位置无差异时,胚胎细胞的膜电位差异不显著;②早期胚胎的细胞膜电位存在个体差异;③早期胚胎的细胞在不同发育阶段具有不同的膜电位,且其膜电位值显著下降;④同—胚胎的周边细胞与内部细胞之间,细胞膜电位存在显著性差异。结论:早期胚胎分化的诱因是不同位置的细胞受到"胚胎场"的影响不同,"胚胎场"是指构成胚胎的细胞,因其具有的膜电位因素在相互之间形成的影响力。     

亚硫酸氢盐测序法检测小鼠胚胎Oct4启动子区甲基化

应用亚硫酸氢盐测序技术,以昆明小白鼠几种不同时期体内胚为研究对象,对其单拷贝基因Oct4启动子区进行甲基化检测.基因组经低熔点琼脂糖包埋、亚硫酸氢盐修饰后,运用巢式PCR对处理后的DNA进行两轮扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测和单克隆测序进行分析.结果表明,亚硫酸氢盐测序法是一项敏感而有效的DNA甲基化检测手段.     

Rho激酶抑制剂Y-27632对小鼠早期胚胎发育的影响

[目的]研究Rho激酶特异抑制剂Y-27632对小鼠早期胚胎发育的影响。[方法]取小鼠早期胚胎2细-胞,经体外培养1~2 d后,进行细胞计数、受体移植,观测Rho激酶抑制剂Y-27632对细胞数目和胚胎着床效率的影响。[结果]早期胚胎经Y-27632处理后,胚胎发育延迟,囊胚出腔脱带时间推后,试验组胚胎桑椹胚、囊胚发育率同对照组差异不显著（P〉0.05）,与同期胚胎相比细胞数目增加,差异显著（P〈0.05）,着床效率相当。[结论]Rho激酶特异抑制剂Y-27632对小鼠早期胚胎细胞数目增加和延迟着床具有重要作用。     

NO对小鼠早期胚胎发育和附植的影响

一氧化氮（NO）是一种具有生物活性的信号分子和细胞毒性因子,它广泛参与体内的生理和病理过程。近年来,国内外的研究学者做了很多关于NO在胚胎附植过程中的作用机理的研究,结果表明：NO参与妊娠和胚胎附植的过程,并对早期胚胎的发育既有促进作用,也有抑制和毒性作用。     

水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列（Oct4：NM_174580,Nanog：NM_001025344）设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列（the coding sequences,CDS）和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,Nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFFs）,逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12-15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;Nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和Nanog基因能转入BFFs中,在mRNA水平和蛋白水平都表达,阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全长和CDS,其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守;逆转录病毒转基因方法将Oct4和Nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。     

鼠、兔核质杂交及早期胚胎发育的研究

以2~8细胞期鼠胚细胞为供体核,选用注射hCG后15h、17h的兔卵母细胞为受体胞质,施加1.6kv/cm、160、两次脉冲的电场条件,间隔20min,融合液为含Ca、Mg的0.3mol/L甘露醇,适于鼠、兔种间EOBC的融合激活。小鼠2-细胞、4-细胞期胚细胞与兔去核卵母细胞融合率高于8-细胞期胚细胞,分别为83%、80%及62.5%,桑囊胚发育率差异不显著。体细胞共同培养系统和Taurine能显著提高鼠、兔核质杂交胚的体外发育能力。     

METTL23基因在猪卵母细胞、早期胚胎和主要器官中的表达

METTL23是一种精氨酸甲基转移酶,通过表观遗传机制调控基因表达,在早期胚胎和器官生长发育方面发挥重要的调控作用。本实验借助在线数据库和基因分析软件对猪METTL23进行生物信息学分析,得知METTL23序列包含5个外显子,定位于12号染色体上,长度4 874 bp,mRNA全长2 501 bp,CDs全长573 bp,编码190个氨基酸。猪和羊之间METTL23同源性最高、亲缘关系最近。同时通过qRT-PCR技术,探究了METTL23在猪卵母细胞、早期胚胎以及心、肝、脾、肺、肾、睾丸和卵巢7种组织器官中的相对表达量。结果发现:MTEEL23在猪卵母细胞和早期胚胎中均有表达,其中生发泡期(Germinal Vesicle,GV)卵母细胞表达量最高,第二次减数分裂中期(Metaphase II,MII)卵母细胞和1-细胞胚胎时期表达量相似,但从1-细胞时期开始表达量逐渐下降,8-细胞时期降至最低,桑葚胚时期开始上升并持续到囊胚;METL23在猪各组织器官中的表达比较稳定,其中肝的表达量最高,其次依次为睾丸>肾>心>卵巢>脾>肺,且差异显著。本研究表明,ME...     

小鼠早期胚胎的EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25玻璃化法冷冻保存

为了筛选适合用于小鼠不同发育时期胚胎的玻璃化冷冻方法,采用EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25 法分别冷冻保存不同发育期的小鼠胚胎.结果表明,采用EFS20/40法冷冻的2细胞期胚经解冻后发育至扩张囊胚的比率(93%)显著高于EFS40、DAP213和GP25法(分别为70.9%、39.1%和11.1%)(P<0.01);采用EFS20/40法冷冻保存小鼠4～8细胞期胚时,与EFS40相比,解冻后发育至扩张囊胚的比率差异不显著(分别为86.2%和90.0%),但与DAP213(64.5%,P<0.05)和GP25法(47.8%,P<0.01)相比其扩张囊胚率显著增高.此外,虽然EFS40法与EFS20/40法冷冻保存小鼠桑椹胚解冻后的扩张囊胚率差异不显著(分别为68.9%和70.8%),但均显著高于DAP213(38.9%)和GP25法(37.5%)(P<0.01).结果表明,EFS20/40法适合用于小鼠的2细胞期冷冻保存,而EFS20/40和EFS40法均适合用于4～8细胞期胚和桑椹胚的冷冻.     

小鼠早期胚胎发育过程中母源基因降解相关内源性小干扰RNA筛选与鉴定

为探究endo-siRNA在小鼠胚胎母源基因降解过程中的功能,通过生物信息学分析对小鼠母源基因和对应小RNA作筛选与鉴定,研究发现近三分之二母源基因为小RNA靶标。母源基因在早期胚胎发育过程中表达模式分析表明endo-siRNA与母源基因表达呈较强负相关,预示endo-siRNA在母源基因降解过程中具有重要功能。验证表明, endo-siRNA可在转录后水平调控母源mRNA水平,调控母源基因降解。研究结果为哺乳动物母胚转换的相关研究提供理论基础。     

小鼠卵母细胞和早期胚胎端粒酶活性的测定

为了解小鼠早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法(TRAP)进行了小鼠卵母细胞和附植前胚胎端粒酶活性的测定。结果表明,小鼠卵母细胞、桑椹胚和囊胚为端粒酶阳性,而2-细胞和8-细胞为阴性。依据电泳条带在成像系统下的光密度,计算相对总产品产量(TPG)的定量比较发现,囊胚端粒酶活性最高,为269.331;桑椹胚次之,为96.231;卵母细胞最低,为85.782。小鼠桑椹胚和囊胚胚胎记数及单细胞端粒酶活性比较结果显示,囊胚单细胞TPG最低,为3.45;桑椹胚单细胞略高于囊胚,为4.00;而卵母细胞最高,为85.782,大约是囊胚细胞的25倍。     

GSH和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究活性氧(ROS)-过氧化氢和抗氧化剂-还原型谷胱甘肽(GSH)对小鼠2-细胞期胚胎体外发育的影响.用含有不同浓度H2O2的mSOF液培养小鼠胚胎,从H2O2浓度0.14 mg/L组开始的囊胚发育率显著低于对照组和其它组(P0.05);以mSOF液为基础液,在添加0.14 mg/L H2O2的基础上分别添加不同浓度的GSH,阳性对照组的囊胚发育率显著高于阴性对照组(P0.05);在添加外源性H2O2(0.14 mg/L)的情况下,随着GSH浓度的增加其囊胚发育率也显著增加.结果表明,H2O2可诱导小鼠2-细胞期胚胎体外发育的阻滞,GSH可阻止H2O2对小鼠2-细胞期胚胎的抑制效果.     

小鼠2和4细胞胚卵裂球电融合参数的研究

用80μs和800,1000,1200,1400V/cm的脉冲获得的2细胞胚卵裂球融合率分别为53％(21/40),70％(32/46),82％(36/44),81％(29/36);用1200V/cm和80,160,320μs的脉冲获得2细胞胚卵裂球的融合率分别为82％(36/44),92％(44/48),70％(26/37)。用160μs和1400,1600,1800V/cm的脉冲获得的4细胞胚卵裂球融合率分别为77％(27/35),91％(39/43),79(30/38);用1600V/cm和80,160,320μs的脉冲获得的4细胞胚卵裂球融合率分别为73％(29/40),91％(39/43),77％(27/35)。2,4细胞胚卵裂球融合的适宜条件分别是1200V/cm和160μs,1600V/cm和160μs。     

团头鲂转录因子Oct4的原核表达和多克隆抗体的制备

为进一步分析鱼类干细胞多能性转录因子Oct4的功能,将团头鲂(Megalobrama amblycephala)Oct4进行原核表达并制备了兔抗Oct4多克隆抗体。采用RT-PCR方法从团头鲂卵巢中扩增Oct4基因的部分编码片段,插入载体pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-MaOct4;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导、Ni~(2+)亲和柱层析纯化获得分子量约49 ku的可溶性重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗体,通过ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。实验结果表明:该重组载体在37℃,0.5 mmol/L IPTG条件下诱导4 h可获得Ma-Oct4重组蛋白的高效表达;制备的团头鲂Oct4多克隆抗体能够分别与纯化的Oct4蛋白、原核表达的Oct4蛋白、团头鲂胚胎中的内源Oct4蛋白以及HepG2细胞中过表达的Ma-Oct4:DsRed融合蛋白特异结合。为后续深入研究团头鲂Oct4在干细胞多能性调控中的作用提供了有效的分子工具。