甘蔗14-3-3基因真核表达载体构建及分析

该实验拟构建甘蔗14-3-3基因的真核表达载体,为体外研究该蛋白功能和高级构象特征奠定基础。用RT—PCR技术从甘蔗茎中扩增出编码14-3-3蛋白的全长基因,并连入pGEM—T载体中,双酶切和测序用于序列正确性的鉴定。结果表明,该基因的最大开放阅读框为771bp,编码6256个氨基酸。后将所得cDNA片段亚克隆至真核表达载体pPIC9K,经电转后在酵母细胞中表达,表达产物经Westernblot鉴定分子量约为28kD。表明已成功构建了甘蔗14—3—3蛋白真核表达载体,并获得了表达产物。     

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因(Bactrocera dorsalis14-3-3,Bdor14-3-3),研究Bdor14-3-3mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor14-3-3;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头(去除触角)和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor14-3-3可能发挥着重要作用。     

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因（Bactrocera dorsalis 14-3-3,Bdor 14-3-3）,研究Bdor 14-3-3 mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor 14-3-3;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头（去除触角）和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28 和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor 14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor 14-3-3可能发挥着重要作用。     

茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析

【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1 110个茶树花蕾cDNA片段中,122个（10.9%）是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因（GenBank登录号：DQ444463）,其全长为1 072 bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。     

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-1和HaFT-2克隆及表达分析

根据前期梭梭干旱转录组测序得到的Unigene序列,成功克隆2个梭梭14-3-3蛋白基因,分别命名为HaFT-1和HaFT-2,并对其进行基因表达分析。结果表明:HaFT-1基因在梭梭的根、种子中均可表达,且根中表达最强;HaFT-2基因在梭梭同化枝中表达最强,根的表达量次之。干旱胁迫后HaFT-1和HaFT-2基因的表达量均下调。本研究初步分析HaFT-1、HaFT-2基因的表达模式,为进一步研究该基因功能奠定基础。     

短柄草14-3-3基因家族的生物信息学及表达模式研究

在短柄草基因组中共鉴定出7个14-3-3蛋白家族成员,与水稻、拟南芥14-3-3蛋白的系统进化分析发现,7个短柄草14-3-3蛋白中有1个属于ε类蛋白,其他6个属于非ε类蛋白.对短柄草14-3-3蛋白家族的序列相似性、基因结构以及蛋白结构分析发现,短柄草14-3-3蛋白序列及三维结构高度保守.RT-PCR分析显示,7个短柄草14-3-3基因在不同的组织中均表达,预示着它们在植物体内可能都具有生物学功能.     

杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式研究

14-3-3蛋白在植物细胞信号传导中发挥重要的作用,探索木本植物14-3-3蛋白家族的进化模式对深入理解该基因家族的功能有重要的指导意义。本文采用生物信息学的方法,在基因组水平上搜索和鉴定了12个杨树14-3-3蛋白基因,其中ε类有7个,非ε类有5个。通过对杨树14-3-3基因家族的系统进化、序列相似性、基因结构和染色体位置分析,发现杨树14-3-3基因的扩张主要是通过最近的一次全基因组加倍事件产生的。在全基因组加倍事件中共产生5对重复基因对,Ka/Ks分析显示这5对重复基因对处于较强的净化选择压力。RT-PCR分析显示在杨树12个14-3-3基因中有8个在不同组织中均表达,另外4个基因的表达部位发生了变异。因此,杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式的研究结果预示着基因重复后其功能发生了分化。     

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9的克隆及特性分析

【目的】分析梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9在不同胁迫下的表达模式,解析HaFT-9蛋白结合特性,为研究梭梭抗逆分子机制提供理论基础。【方法】以梭梭cDNA为模板克隆14-3-3蛋白基因HaFT-9,利用qRT-PCR技术对该基因在不同胁迫下的表达模式进行分析,并通过酵母双杂交实验验证HaFT-9蛋白结合特性。【结果】克隆得到ORF长度为789 bp的梭梭14-3-3蛋白基因,命名为HaFT-9。梭梭幼苗在20% PEG6000、200 mmol/L NaCl和100 μmol/L ABA处理下,HaFT-9的表达量均在胁迫6 h时达到峰值,在20 μmol/L IAA处理下,HaFT-9的表达量在胁迫1 h时达到峰值。梭梭幼苗经40、55℃和55、65℃模拟地表高温胁迫,高温胁迫适应性试验中的常温复原阶段HaFT-9均上调表达。酵母双杂交实验表明HaFT-9可与自身形成同源二聚体。【结论】克隆得到HaFT-9基因(登录号为API85525.1),该基因可响应干旱胁迫、盐胁迫、ABA和IAA处理,并与高温胁迫适应性相关,HaFT-9蛋白能与自身互作形成同源二聚体。     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析

[目的]克隆分析香蕉中14-3-3蛋白编码基因。[方法]采用PCR与RACE技术相结合的方法克隆香蕉14-3-3基因,并进行CDNA测序及同源性分析。[结果]所克隆cDNA全长866 bp,编码197个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的特征结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的序列相似性,将其命名为Ma-14-3-3d(Musa acuminate14-3-3gene)。[结论]Ma-14-3-3d蛋白与来源于单子叶植物的14-3-3蛋白位于同一进化枝上。     

普通菜豆14-3-3蛋白基因PvGF14h的克隆及冷胁迫诱导表达分析

根据14-3-3蛋白的保守性及菜豆基因组信息,从普通菜豆品种东北小油豆中克隆了一个14-3-3蛋白基因PvGF14h.生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白以α螺旋为主导结构,具有典型的14-3-3蛋白结构域,主要分布在细胞质与过氧化体中,具有磷酸化位点;序列比对及进化树分析表明,它与大豆14-3-3蛋白SGF14h有较高的同源性(可达98.1％);进一步利用实时定量RT-PCR分析PvGF14h响应冷胁迫的表达模式,结果表明该基因的表达随着冷胁迫处理时间的增长而增加,因此推测PvGF14h可能参与了冷胁迫的信号转导过程.这些关于菜豆14-3-3蛋白基因的基本信息为进一步研究其功能尤其在响应低温胁迫方面奠定了基础.     

甜瓜14-3-3基因家族全基因组鉴定与进化分析

以拟南芥的14-3-3蛋白保守结构域为探针序列,对甜瓜全基因组的蛋白质数据库进行搜索,获得9个14-3-3蛋白序列,其中ε类5个、非ε类4个。对甜瓜14-3-3基因家族进行了系统发生分析、内含子数量分析、序列相似性比对,通过对所有甜瓜的14-3-3蛋白相匹配的Unigene分析后发现,部分基因在多种组织中均有表达,部分基因在甜瓜果实以及花中高丰度特异表达,而且不同成员之间的表达模式存在较大差异。甜瓜14-3-3基因家族成员的分子进化及表达模式的研究结果表明基因重复后发生功能分化。     

马铃薯腐烂茎线虫14-3-3基因的克隆与序列分析

马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是为害中国甘薯生产的主要病原物之一,由它所引起的甘薯茎线虫病,每年造成严重的经济损失。14-3-3蛋白是真核生物特有,具有高度的保守性,且在信号转导代谢调控、激素信号传导、细胞分裂和对生物和非生物刺激的应答反应等过程起到重要作用。本研究采用EST分析和RACE克隆相结合的方法,从马铃薯腐烂茎线虫中成功克隆出一个14-3-3蛋白基因（Dd-14-3-3a,GenBank accession NO.:ADW77527.1）。Dd-14-3-3a cDNA全长为986 bp,包含一个长度为756 bp的开放阅读框,编码着一个长度为251 aa的蛋白质。Blast比对结果表明：Dd-14-3-3a蛋白与已报道的南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）、大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）以及水稻干尖线虫（Alphelenchoides besseyi）中的14-3-3蛋白的一致性分别为98%、98%、98%和97%。对该蛋白结构的分析结果表明：Dd-14-3-3a蛋白包含一个典型的14-3-3蛋白结构域,且无信号肽和跨膜结构域。该基因的克隆和分析将有助于明确植物寄生线虫14-3-3蛋白在线虫侵染和与寄主互作中的作用。     

小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达

【目的】克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础。【方法】根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化。【结果】从开花后灌浆13-15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD。核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98%,编码蛋白氨基酸长度也一致（260 aa左右）;在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致。从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达。将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式（80%）存在。对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂糖树脂得到了高度纯化的重组蛋白。【结论】利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白。     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析(英文)

[Objective] The aim of the study is to clone and analyze the gene encoding 14-3-3 protein from banana. [Method] Combined with PCR amplification, RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique was employed to clone 14-3-3 gene from banana; then the amplified sequence was sequenced and homologically analyzed. [Result] A new cDNA homologous with 14-3-3 protein genes were obtained by RT-PCR and RACE ( rapid amplification of cDNA ends ) approaches. The full length of this cDNA was 866 bp encoding 197 amino acids. Alignment of deduced amino acid sequence with those from other plants revealed that the cDNA shared high homology with 14-3-3 protein genes from other plants, and was designated as Musa acuminata 14-3-3 gene (Ma-14-3-3d). Phylogenetic analysis reveals that Ma-14-3-3d has closer genetic relationship with those from monocotyledon species than those from other species. [Conclusion] Ma-14-3-3d belongs to the same lineage of 14-3-3 from monocotyledon.     

不结球白菜S位点受体激酶基因片段的克隆与表达分析

以不结球白菜自交不亲和系03的基因组DNA和柱头cDNA为模板,利用引物SRKF/SRKR扩增获得长度为964 bp和646 bp的SRK基因片段。序列比较分析表明,克隆的基因片段属于SRK基因的激酶域,该序列包含4个外显子和3个内含子,编码215个氨基酸,与芜菁、甘蓝、芥蓝等SRK基因有90%以上的相似性。荧光定量PCR分析结果表明:自交不亲和系03和自交亲和系105不同组织中SRK基因的表达水平存在显著的差异,SRK基因主要在自交不亲和系的柱头中高度表达,自交亲和系中该基因的表达主要分布于叶片、花蕾和柱头组织中。     

不结球白菜晚抽薹BcFLC1基因克隆及表达分析

采用RT-PCR、5'RACE和3'RACE方法,克隆得到了不结球白菜NJ074晚抽薹基因(BcFLC1)的cDNA全长序列。对BcFLC1基因所编码氨基酸序列的理化性质进行分析推测得到:该基因cDNA全长909bp,包含576bp的开放阅读框,编码191个氨基酸。不结球白菜BcFLC1蛋白功能域预测分析结果表明:该基因为MADS盒基因,其编码蛋白的1～60氨基酸属于MADS盒基因蛋白。荧光定量PCR分析表明:BcFLC1基因在不同生长发育阶段叶片中的表达情况不同,抽薹前高于抽薹后叶片中的表达量。BcFLC1基因在不同部位表达也存在差异,表达量从高到低依次为:叶、茎、花蕾、花和根。