库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。     

苹果褪绿叶斑病毒的ELISA检测技术研究

比较了直接双抗体夹心法（DAS－ELISA）和间接双抗体夹心法（F（ab)2-ELSIA)检测CLSV的范围（不同株系）,并分析了在病毒提取介质中加入某些特殊成分后,对直接双抗体夹心法检测CLSV效果的影响。结果表明,间接法可以检测较宽的病毒株系;当常规病毒提取介质中加入尼古丁、氯化 镁和聚酰胺时,标准双抗体夹心法的检测范围也可以扩大。     

苹果褪绿叶斑病毒一步法RT-PCR检测

RT-PCR技术在植物病毒检测方面有着快速、灵敏、特异性强等优点。然而传统的RT-PCR是在两个酶(逆转录酶和Taq酶)分别催化下在两个体系中的两步反应,即由RNA逆转录为cDNA,再以模板cDNA进行PCR扩增,操作步骤比较繁琐,而且很容易造成交叉污染。笔者建立的一步法RT-PCR是在逆转录酶(M-MLV)和Taq DNA聚合酶共同作用下,只需在一个反应管中就可以完成反转录和cDNA扩增的全过程,两个步骤一步完成,以达到对苹果褪绿叶斑病毒快速、简便、敏感的检测。     

利用酵母双杂交筛选与苹果褪绿叶斑病毒CP互作的寄主因子

【目的】利用酵母双杂交系统筛选与苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）外壳蛋白（coat protein, CP）互作的寄主因子,利用生物信息学方法分析其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【方法】首先构建ACLSV CP的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold中,测定转化菌在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上的生长情况,从而判断其在酵母双杂交过程中对报告基因的自激活活性。将pGBKT7-CP及pGBKT7分别转化至酵母菌株Y2H gold,培养不同时间后,用紫外分光光度计测定OD₆₀₀值,分析pGBKT7-CP对酵母菌生长的影响;然后通过顺序转化的方法自前期已构建好的苏俄苹果（Malus sylvestris cv. R12740-7A）cDNA文库中钓取与ACLSV CP互作的因子,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选生长良好的蓝色阳性菌落,测定序列,并在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【结果】成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold后,转化菌只能在SD/-Trp平板上正常生长,不能在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上生长,表明重组质粒自身不能激活报告基因His及Ade的表达,没有自激活活性。酵母双杂诱饵载体pGBKT7-CP与对照空质粒转化菌生长情况相似,证明诱饵载体对酵母菌没有毒性;筛选到了69个互作寄主基因,包括转录因子活性、碳固定活性、细胞内铁离子平衡、防御反应、水解酶活性、氧化酶活性、氧化还原酶活性、光系统II组件、绑定蛋白等10类蛋白,经生物信息学分析,其中8个寄主基因（Malus3-1、Malus4-2、Malus4q1、Malus31-3、Malus49q2、Malus15-1、Malus6-2、Malus91-4）可能在病毒与寄主互作过程中起重要作用。【结论】分析筛选到的重要寄主蛋白功能,推测ACLSV CP与BZIP类、MYB类转录因子、病程相关蛋白（PR-5、PR-8、PR-10）互作,可能调控了寄主对病毒的抗性作用;与光系统II（PSII）的稳定性/装配因子蛋白、铁结合蛋白互作,影响植物光系统的稳定性及叶绿素的形成,从而降低光合作用。这将为揭示ACLSV导致寄主产生褪绿叶斑及树体衰退的原因提供理论依据。     

褪绿叶斑病毒（CLSV）对苹果属植物过氧化物酶活性及同工酶的影响

26个苹果属植物种类受苹果褪绿叶斑病毒(CLSV)侵染后,其过氧化物酶活性升高,嫁接后95天内出现1或2个增酶高峰.同工酶的谱带也增多,特别是B 区变化更为明显,但不同种类反应不一,楸子、酸苹果等对CLSV 抗性强的种类出现2个增酶高峰,且表现时间早,峰值低,同工酶出现2次特异性谱带;冬白果等对CLSV 敏感的种类则只有1个增酶高峰,表现时间迟,峰值高,只出现一次特异性谱带。这种过氧化物酶活性及其同工酶谱的变化可作为鉴定苹果属植物对CLSV 的抗性的生化指标.     

苹果潜隐病毒快速检测

该文以优系短枝富士为主要试材，采用木本指示植物和间接酶联免疫（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）两种方法，对苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＳＧＶ）和苹果茎痘病毒（ＳＰＶ）进行了检测．试验表明，俄罗斯苹果Ｒ１２７４０－７Ａ、司派２２７和弗吉尼亚小苹果３种指示植物可作为上述３种潜在病毒的鉴定植物．植物生长状况对鉴定结果有重大影响．间接酶联免疫检测速度快，准确度高．该试验所用最佳抗体工作浓度ＣＬＳＶ：第一抗体１／６０００，第二抗体１／２０００；ＳＧＶ：第一抗体１／５０００，第二抗体１／３０００．     

3种苹果潜隐性病毒一步多重RT-PCR检测体系的优化

为建立更为快速准确的苹果潜隐性病毒检测方法,以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的田间苹果成龄树为试材,设计合成了扩增目的片段为273 bp(ASGV)、358bp(ACLSV)和432 bp(ASPV)的3对特异性引物,并对影响RT-PCR体系的主要参数进行试验优化.结果表明:建立的一步多重RT-PCR体系可以实现对3种主要潜隐性病毒的特异性检测;通过对田间多个样品的检测验证,表明该方法的准确性和灵敏度都很高,并缩短了单个样品的检测时间,极大地提高了工作效率.     

苹果病毒病的危害及防治技术探讨

为了解决苹果病毒病危害问题,本文将结合文献资料查阅结果和自身工作经验进行总结,归纳了一些苹果病毒病类型,选取隐性ACLSV为例,开展ACLSV相对含量分布试验。本文依据病毒分布情况,将防治技术合理应用至ACLSV防治方案中,旨在改善苹果病毒病危害现状。     

苹果褪绿叶斑病毒的抗血清制备及其检测应用研究

用昆诺藜(Chenopodium quinoa)为诊断和分离寄主,从混合感染潜隐病毒的苹果花瓣中分离纯化出苹果褪绿叶斑病毒。经纯化的病毒,在繁殖寄主—昆诺藜上增殖扩大。采用聚乙二醇沉淀和差速离心技术,从感染病毒的昆诺藜中提纯出褪绿叶斑病毒作为抗原,免疫家兔,经心脏采血,制备出了该病毒的抗血清。用制备的抗血清进行了检测褪绿叶斑病毒的方法和对脱毒苗以及生产苹果树的带毒情况作了初步研究。A蛋白酶联免疫法适于检测苹果褪绿叶斑病毒。     

生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒

以含苹果锈果类病毒(ASSVd)全长序列的重组质粒PUC为模板DNA,加入ASSVd类病毒特异性引物,应用聚合酶链式反应技术(PCR)合成了生物素标记的cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针最适使用浓度为1/10,探针检测感病的ASSVd类病毒的最大稀释倍数是1/100。利用制备的探针进行田间检测,结果与RT-PCR检测结果一致,阴性对照均无杂交信号出现。     

用核酸探针技术检测脊尾白虾体内的白斑综合症病毒

用斑点杂交和原位杂交检测了从病虾池捕获的脊尾白虾体内的WSSV。8尾脊尾白虾的斑点杂交检测阳性率为100%;脊尾白虾胃的上皮组织和结缔组织、位于鳃区头胸甲处的角化上皮、头胞甲反缘与虾体相连的角化上皮、结缔组织、附肢外的角化上皮、鳃丝的柱状上皮及其腔隙内的血淋巴、肝胰腺小管间的上皮组织及其血窦内的血淋巴、头胸甲的肌肉、造血组织、脊尾白虾精荚之结缔组织细胞、卵巢的结缔组织及其滤泡细胞原位杂交呈阳性。以上结果进一步证实了脊尾白虾是WSSV的天然宿主。     

库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究

 以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对 2种总RNA提取方法进行了比较研究 ,从中行筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法 ;并利用RT PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针 ,在此基础上 ,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了试验研究 ,结果表明 ,当探针浓度为 4 0 0ng·ml-1,甲酰胺浓度为 4 5 % ,4 2℃杂交反应 6h ,可获得最高灵敏度。进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好 ,基本无背景。Tween2 0的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测 ,结果表     

棉花皱叶病毒LAMP检测方法的建立

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是危害棉花的重要病毒之一,属中国进境检疫性植物病毒,本研究根据其DNA-B基因序列设计LAMP特异性引物,通过试验建立CLCrV的LAMP检测方法。该方法检测快速,15min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同属的CLCrV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)及番茄黄化曲叶病毒(TYLCV);灵敏度高,可检测到约43fg/μL的总DNA,比普通PCR灵敏度高1 000倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应进行结果判断。该方法适用于现场CLCrV的快速检测。     

利用原位杂交及原位RT-PCR技术检测梨树组织中苹果茎痘病毒的分布

 【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布,为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料,利用非放射性标记物地高辛（DIG）,通过RT-PCR反应体系,合成了苹果茎痘病毒的cDNA探针,利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片,利用原位反转录酶聚合酶链式反应（IS-RT-PCR）技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布,并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶K消化时间以20 min为宜,要获得良好的扩增效果,RT 反应体系中RNasin的量需大于0.2 U?μl-1,dNTPs大于0.4 mmol?L-1,SuperScriptⅡ在0.1～1.3 U?μl-1,引物在0.9 μmol?L-1以上。PCR反应体系中适宜的退火温度为60℃,循环35次,引物浓度应在0.8～1.2 μmol?L-1,LA Taq酶浓度大于0.5 U?100?μl-1。【结论】梨树茎尖顶端分生组织0.25 mm的区域为无病毒区域。