猪链球菌9型cps9G基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪链球菌9型(SS9)基因的核酸序列,设计一对引物,采用PCR方法从确诊为猪链球菌的阳性样品中扩增cps9G基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,转化DH5a感受态细胞,提取重组质粒pMD18T-cps9G,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上SS9相应序列进行同源性分析.结果表明,经PCR扩增,鉴定为SS9的有8株.序列分析发现,8株SS9的cpsgG片段的核苷酸序列较稳定,该基因片段长度均为562 bp,彼此间的核苷酸同源性达96.8%～99.8%,亲缘关系密切;与GenBank上已发表的SS9参考毒株的同源性介于96.0%～98.6%.     

猪链球菌ZJ株溶血素基因的克隆和序列分析

猪链球菌ZJ株溶血素（suilysin）基因（sly)用特异引物进行PCR扩增后，采用T-A克隆策略将其克隆至E.Coli DH5a。PCR产物和重组质粒酶切分析表明该基因与已报道的sly基因一致，核苷酸序列分析表明sly基因与P1/7株和1933株的同源性分别为99.6%和99.7%。     

猪链球菌2型四川分离株毒力基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌2型的MRP、EPF和SLY基因设计合成了四对引物,对我们分离鉴定的2005四川分离株进行毒力因子检测,并对阳性产物测序比较。结果以分离株为模板,获得了与预期结果一致的867bp(MRP)、572bp(EF)的2个片段,以及SLY的长度为1502bp目的片段(外引物)和1443bp的目的片段(内引物)。说明分离株SSsc0501为MRP+EF+SLY+,属于具有3种主要毒力因子的强毒株。经对PCR阳性产物测序及序列分析,结果其与P1/7株的核苷酸序列完全一致,与1933株的同源性达99.7%,仅在128位、217位、744位、1380位、1386位的5个核苷酸发生突变。在氨基酸水平上SSsc0501株与1933株的同源性达99.6%,有2个氨基酸发生替代。     

猪链球菌血清2型JX02株溶血素基因的克隆及序列分析

采用特异性引物对猪链球菌2型(Streptococus suis type 2)JX02菌株进行PCR扩增，将扩增到的溶血素基因克隆到pMDl8-T质粒栽体中，经鉴定后测序。结果显示，扩增的JX02株溶血素基因长度为1494bp，与P1／7株和US-1933株等进行序列比较，核苷酸同源性为100％和99．7％，氨基酸序列同源性为100％和99．8％。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为1496bP目的片段的引物，建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌2型参考株SS2—N株的检测结果为阳性，对马链球菌善疫亚种(C群)参考株ATCC35246、分离株SESZ—Y、SESZ—T、SESZ—C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏茵的检到结果均为阴性；用EcoR I内切酶进行酶切．获得了与预期结果一致的863bP和633bP的2个片段。经对SS2—1株的PCR产物进行测序及序列分析，表明其与1933株、P1／7株的核苷酸同源性分别为99．7％和100％。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因检测及序列分析

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）溶血素基因（sly）设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物，对HA9801等6株猪链球菌2型江苏分离株，1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC35246的核酸进行PCR扩增，结果显示HA9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性．ATCC35246呈阴性。HA9801株PCR产物纯化后测序．序列分析表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99％。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白（PrP）基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽（九肽）重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸（除LT200302为23个氨基酸外）的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.     

猪链球菌2型湖南分离株4种毒力基因的序列分析

本试验对猪链球菌2型湖南分离株的cps2j、mrp、epf、sly四种毒力基因进行部分序列扩增、测序后分析,结果表明,4株2型猪链球菌均可检出这四种毒力基因,其中cps2j、epf、sly三基因与国内外报道其他分离株具有很高同源性(98%以上)。然而湖南分离株Hunan-An1、Hunan-An2、Hunan-Ping的mrp基因与其他对比菌株相比同源性低,进化关系远,有较大变异。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

羊朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从6只羊（3只藏绵羊和3只山羊）全血中提取基因组总DNA，用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因，并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，为包含在单一外显子内的完整开放阅读框，其与国外报道的已知序列基本相同。所克隆的羊PrP基因含5个短而富含G-C的元件，可编码八肽Pro—His—Gly—Gly—Gly—Trp-Gly—Gln或九肽Pro—Gln／His—Gly—Gly—Gly-Gly—Trp—Gly—Gln。这些PrP基因序列相比较，其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99．0％～100．0％和98．1％～100．0％之间。共发现17个碱基替换，其中6个为同义码替换、11个为异义突变。异义突变中，除SY200301～SY200303的S240P和MY200301的M112T外，其余均位于PrP氨基酸125～228的C-端球形结构区，分别为MY200301的G129S突变、MY200302的T191R突变、MY200303的G127S突变及SY200302和SY200303的H143R和R211G。6个羊PrP基因均为密码子136、154和171的PrPARQ等位基因。     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因（mrp）的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a（＋）中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带（27.0 ku）。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

Construction and Immunogenicity Analysis of Streptococcus suis rGDH Prokaryotic Expression Vector

Glutamate dehydrogenase (GDH) which exists in 35 serotypes of Streptococcus suis,is an immunogenic protective antigen.Therefore,the GDH gene was amplified by PCR method,and the GDH gene PCR fragment was inserted oriented to pET-32a to construct a new recombinant expression vector pET-32a-GDH.The E.coli BL21(DE3)(pET-32a-GDH) was cultured and induced to express the rGDH protein.New Zealand White rabbits were immunized by the purified rGDH protein for immunity protective test to determine the immunogenicity of the protein.The results showed that the recombinant expression vector pET-32a-GDH was successfully constructed,and the rGDH protein was efficiently and solubly expressed.70% of model animals immuned by the rGDH protein with propolis as adjuvant were protected after injection of Streptococcus suis type 2 as a virulent pathogen.The experiment results provided technical support for the development of subunit vaccine of Streptococcus suis.     

猪链球菌rGDH蛋白原核表达载体的构建及免疫原性分析

谷氨酸脱氢酶(GDH)在猪链球菌35个血清型中都存在,是一种具有免疫原性的保护性抗原。本试验PCR扩增出GDH基因,酶切定向插入pET-32a中构建表达载体pET-32a-GDH,将其转化E.coli BL21(DE3)表达菌中,培养并诱导表达rGDH蛋白,产物纯化后免疫新西兰白兔,免疫攻毒保护试验检验该蛋白的免疫原性。PCR试验获得约1 300 bp的GDH基因,双酶切pET-32a-GDH表达载体获得5.4和1.3 kb的片段,IPTG诱导表达获得融合蛋白,免疫保护结果达到70%。结果表明,本试验成功构建表达猪链球菌GDH蛋白的原核表达载体pET-32a-GDH,rGDH蛋白以蜂胶为佐剂免疫模型动物后,免疫保护率达到70%,为猪链球菌亚单位疫苗的研制提供了技术支持。     

血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析

为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5％(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98％和97％以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切.     

Cloning and characterization of the glutamate dehydrogenase gene in Streptococcus bovis

Streptococcus bovis, an etiologic agent of rumen acidosis in cattle, is a rumen bacterium that can grow in a chemically defined medium containing ammonia as a sole source of nitrogen. To understand its ability to assimilate inorganic ammonia, we focused on the function of glutamate dehydrogenase. In order to identify the gene encoding this enzyme, we first amplified an internal region of the gene by using degenerate primers corresponding to hexameric family I and NAD(P)⁺ binding motifs. Subsequently, inverse PCR was used to identify the whole gene, comprising an open reading frame of 1350 bp that encodes 449 amino acid residues that appear to have the substrate binding site of glutamate dehydrogenase observed in other organisms. Upon introduction of a recombinant plasmid harboring the gene into an Escherichia coli glutamate auxotroph lacking glutamate dehydrogenase and glutamate synthase, the transformants gained the ability to grow on minimal medium without glutamate supplementation. When cell extracts of the transformant were resolved by blue native polyacrylamide gel electrophoresis followed by activity staining, a single protein band appeared that corresponded to the size of S. bovis glutamate dehydrogenase. Based on these results, we concluded that the gene obtained encodes glutamate dehydrogenase in S. bovis.     

猪链球菌病研究进展

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人兽共患病病原体,能够引起猪的疫病,人类感染该菌可导致脑膜炎、败血症,甚至死亡.该菌对养猪业造成严重经济影响,对公共卫生事业构成巨大威胁.由于猪链球菌血清型较多,抗原结构复杂,在临床上又可呈现不同的症状,如败血症、脑膜脑炎、心内膜炎、肺炎、化脓性淋巴结炎、关节炎等,还常常与其他疾病发生合并感染.近几年来,该病的发病率和死亡率有逐年上升趋势.链球菌的致病性已引起临床工作者和科研人员的广泛关注和重视,国内外许多学者对猪链球菌做了大量的研究工作,已发现的猪链球菌2型的致病因子包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子、蛋白质片段和IgG结合蛋白、溶血素等.     

猪链球菌病的流行病学

猪链球菌（Streptococcus suis）可感染人和动物,引起脑膜炎、败血症、关节炎等,甚至死亡。随着分子生物学、微生物学和流行病学的发展,对猪链球菌（病）的流行病学有了一些新的认识。本文围绕猪链球菌的特性、流行特点以及我国和其他国家的猪链球菌病流行情况等4方面,系统介绍了该病当前的流行范围、程度、趋势和规律等,为本病的防控提供可参考的流行病学依据。