玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63及其抗生素高产菌株差异蛋白分析

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。前期研究表明,该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌、瓜类白粉病菌等多种重要的植物病原真菌具有较强的抑制作用,具有良好的生防应用潜力。本文利用蛋白质双向凝胶电泳技术研究了Men-myco-93-63与其抗生素高产菌株D12-3之间的蛋白质表达差异。通过优化条件,建立了一套适合该生防菌的双向电泳体系。通过比较蛋白质图谱的差异,发现了四个差异蛋白,质普分析表明,四个蛋白点分别为聚羟基脂肪酸（PHAs）的包涵体蛋白（PhaP）,β-内酰胺酶(Beta-lactamase),甲基接受趋化蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein)和ABC转运体(ABC transporter, ATP-binding protein),这些蛋白可能与该生防菌的抗性有关.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63与其突变株间的DNA多态性分析和序列特征性扩增区域(SCAR)标记

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus )Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。前期研究表明,该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）等多种重要的植物病原真菌具有较强的抑制作用。利用AFLP对Men-myco-93-63及其8株抗生素生物合成阻断突变株进行了基因组DNA多态性分析。结果表明,38对AFLP引物共产生3 142条谱带,其中2 362条为多态性谱带,占总带数的75.2 %。从96对引物中筛选得到了3对引物：E-CA/M-GA,E-GA/M-AC和E-GA/M-AG,分别扩增出254、312和209 bp 3条仅在Men-myco-93-63中存在,命名为EM254、EM312和EM209。将这3个片段回收、克隆和测序,成功地将其转化为SCAR标记,可以更加方便地用于对突变株的分子检测。     

玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因的克隆及拼接表达

应用PCR扩增克隆到玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的几丁质酶基因chiC的整个催化域部分,将其与包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的链霉菌(S.lividans)chiC基因片段相连接,插入pET23b( )质粒上,构建表达载体pLCH,用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(DE3),转化子进行破壁之后在胶体几丁质酶培养基上表现活性。     

植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析

从土壤中筛选到产植酸酶活性较高的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株03214，其植酸酶最适pH值为1．5和2．5，最适温度为50℃，植酸酶表达量为345U／mL发酵液。通过对黑曲霉03214植酸酶phyA基因进行PCR扩增，获得了1条长约1．5kb的特异性产物。以pMD18-T为载体，构建了含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列测定表明，目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列，基因全长1506bp，其中包含一段长102bp的内含子，编码467个氨基酸，有10个潜在的糖基化位点，5′端有一编码19个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶的进一步研究提供了新的材料。     

Isolation and antifungal and antioomycete activities of staurosporine from Streptomyces roseoflavus strain LS-A24

The actinomycete strain LS-A24 active against some plant fungal and oomycete pathogens was isolated from a soil sample of the Sunghwan Lake in Korea. The cell wall composition and spore shape of strain LS-A24 were LL-diaminopimelic acid and spiral type, respectively. On the basis of the physiological and biochemical characteristics and 16S ribosomal DNA sequence analysis, strain LS-A24 was identical to Streptomyces roseoflavus. An antifungal and antioomycete antibiotic was isolated from LS-A24 using various chromatographic procedures. The molecular formular of the antibiotic was determined to be C(28)H(26)N(4)O(3), and on the basis of the NMR data, the antibiotic was confirmed to be staurosporine, 2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one. Staurosporine completely inhibited the mycelial growth of Colletotrichum orbiculare, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, and Cladosporium cucumerinum with minimum inhibitory concentration (MIC) values of 1-50 microg/mL for MICs. Staurosporine also was active against Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis ssp. subtilis, and Xanthomonas vesicatoria. Staurosporine and the commercial fungicide metalaxyl inhibited the development of Phytophthora blight on pepper plants. However, the control efficacy of staurosporine against the Phytophthora disease was somewhat less than that of metalaxyl. This is the first study to isolate staurosporine from S. roseoflavus and demonstrate its in vitro and in vivo antioomycete activity against P. capsici.     

天蓝色链霉菌中新型双组分系统DraR-K对抗生素生物合成的差异调控

双组分调控系统(two-component system, TCS)是原核生物中最主要的信号转导系统,通常由组氨酸激酶和效应调节蛋白两类在结构上相对保守的蛋白组成。双组分调控系统在链霉菌抗生素合成复杂的代谢网络调控中起着重要的作用。近期中国中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所的研究人员发现天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中存在一个新型双组分调控系统由 DraR 和 DraK 两个蛋白组成,被命名为 DraR-K。他们的研究发现 DraR 和 DraK 任何一个基因缺失都能导致分别添加不同氮源的基础培养基上生长的天蓝色链霉菌中放线紫红素的合成显著降低,但是十一烷基灵菌红素能够显著增加。同时发现这些突变体在添加谷氨酸盐的基础培养基上能够过量表达 I 型聚酮类黄色素。     

淡紫灰吸水链霉菌及其紫外诱变菌株用于害物生防研究

从国内外不同生态条件下采集的土壤标本中分离到７０多个吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）,用其发酵离心上清液对水稻、稗草秧苗和稻纹枯病菌、恶苗病菌进行生物测定,结果有３个菌株对稗草根的生长具有较好的抑（杀）效果;有３个菌株对水稻病原菌有很好的抑制生长作用。其中淡紫灰吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕｌｏ－ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）对稗苗及水稻的二种病原     

表达猪源链球菌类M-MRP融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

利用PCR技术,分别扩增马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)ATCC35246株类Mszp基因583￣1063位碱基和猪链球菌(S.suis)2型HA9801株mrp基因298￣827位碱基的片段。通过在类M基因片段的3!端和mrp基因片段的5!端引物添加共同的SacⅠ酶切位点,利用T4连接酶连接,克隆至pET-32a( )载体。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,经IPTG诱导,可获得分子量约为60kD的融合蛋白。通过MRP和类M蛋白的多克隆抗体进行ELISA反应和免疫印迹分析表明:表达的融合蛋白同时具有类M蛋白和MRP的抗原性。用组氨酸亲和层析柱纯化的重组融合蛋白,和链球菌的全菌二联灭活疫苗分别免疫两组仔猪,重组蛋白的免疫保护率达60"。     

肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因，并定向克隆到pET32a(+)中，转化宿主菌BL21（DE3）。重组菌经1mM IPTG诱导，在30℃下，5h时表达产物（分子量约为37KD）达到高峰，表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中，经Western blot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种试验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠，对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析

鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。     

金黄色葡萄球菌乳房炎奶牛血浆的比较蛋白质组研究

为了分析金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)自然感染引起的隐性乳房炎奶牛血浆蛋白的表达变化,经细菌培养分离鉴定了乳中金黄色葡萄球菌,选择其感染的奶牛.采用二维凝胶电泳技术分离了临床健康奶牛和乳房炎奶牛的血浆蛋白,考马斯亮蓝G-250染色后PDQuest 8.0软件检测差异表达蛋白点,高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定.结果发现,金黄色葡萄球菌乳房炎奶牛血浆中有10个蛋白点的表达量发生改变,其中6个蛋白点经质谱鉴定为结合珠蛋白、转甲状腺素蛋白和α1酸性糖蛋白等4种蛋白.金黄色葡萄球菌感染可造成奶牛血浆结合珠蛋白、α1酸性糖蛋白和血清淀粉样蛋白A的表达量增加.ELISA法测定血浆结合珠蛋白的结果也发现,金黄色葡萄球菌感染奶牛血浆结合珠蛋白水平显著高于健康牛(P＜0.01).结果提示乳房炎奶牛血浆蛋白的变化可为揭示金黄色葡萄球菌感染乳腺炎症的应答提供依据.     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株抗菌蛋白的分离纯化

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) DS45-2菌株产生的抗菌蛋白对棉花黄萎病有较强的抗性。用NB培养基摇床振荡培养DS45-2菌株(30℃,180r/min,48h),发酵液经硫酸铵盐析得到抗菌蛋白。经分析,抗菌蛋白对热稳定;对胃蛋白酶、胰蛋白酶均不敏感,对蛋白酶K部分敏感;在碱性条件下稳定,酸性条件下抑菌活性减弱。抗菌蛋白经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和反相层析后,分离纯化出一个抗菌蛋白0组分,经SDS-PAGE检测分子.质量约为23 kDa。