水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

水稻纹枯病菌6 磷酸葡萄糖胺合成酶基因的克隆、测序及表达分析

 为筛选新型水稻纹枯病菌GlmS活性抑制物质,采用3′RACE和5′RACE克隆了水稻纹枯病菌GlmS的基因组DNA序列和完整的cDNA序列。GlmS基因组DNA序列全长2 529 bp,含有8个内含子;GlmS cDNA序列全长2094 bp,推测编码一个含有697个氨基酸残基,分子量约为76.7  kD的蛋白质。生物信息学分析表明水稻纹枯病菌GlmS含有1个谷氨酰胺氨基转移酶结构域和2个葡萄糖异构酶结构域。采用大肠杆菌重组融合表达GlmS,重组蛋白的分子量经过葡聚糖凝胶层析和SDS PAGE电泳测得分别为306 kD和77 kD,表明GlmS是由4个相同大小亚基组成的多聚酶复合体。重组蛋白的酶学性质研究表明其最适反应温度为37℃,最适pH为6.4,42℃下的半衰期为1 h,在pH 5.5～7.5时比较稳定。GlmS催化反应能被己糖胺通路末端产物鸟苷氮乙酰葡萄糖胺反馈抑制。     

水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的克隆及表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内信号转导的重要组分,受多种生物及非生物胁迫的刺激活化。利用RT-PCR方法克隆了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的cDNA序列(GenBank登录号为GQ265780)。该序列全长1660bp,包含1个1629bp的开放阅读框,编码蛋白由542个氨基酸组成,包含典型的蛋白激酶结构域及磷酸化位点TDY基序。序列比对和分析显示,OsMPK14基因位于水稻第5染色体上,其编码区由9个外显子和8个内含子组成。采用半定量RT-PCR技术,检测了光照、低温、高盐、干旱和脱落酸对该基因在水稻地上部分和根中表达的影响。结果显示高盐、低温、脱落酸都能上调其表达,而干旱对其表达具有微弱的抑制效应,光照可以降低该基因在水稻地上部分的表达,提高在根中的表达。基因可能在水稻非生物胁迫的应答中具有重要作用,其表达受多种因素调控。     

5个水稻品种对水稻纹枯病菌鉴别能力的比较

采用苗期接种法和大田成株期接种法,对5个具有不同纹枯病抗性的水稻品种Lemont、武育粳3号、Jasmine85、C418和YSBR1进行纹枯病抗性评价。苗期接种结果表明,30个来源不同的纹枯病菌接种5个品种后,5个品种苗期表现出明显的抗感差异,30个菌株之间致病力差异亦明显,且品种与菌株之间互作显著。根据聚类分析结果,从30个菌株中筛选出5个致病力不同的菌株(分别为GD118、C30、E67、YN7和YN3)进行水稻品种成株期抗性鉴定,发现水稻品种成株期的抗感差异亦显著。     

大豆GmAMS基因及其启动子的克隆和表达分析

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)转录因子在植物雄配子发育中具有重要的调控作用。为探究bHLH转录因子在大豆花发育中的作用,以大豆细胞质雄性不育系NJCMS5A的花芽cDNA和叶片DNA为模板,通过RT-PCR克隆得到具有典型bHLH结构域的GmAMS基因及其启动子区域,并进行生物信息学分析和时空表达分析。生物信息学分析结果显示GmAMS基因的编码区序列全长为1 716 bp,编码571个氨基酸。亚细胞定位预测GmAMS位于细胞核中。荧光定量分析结果显示,相对于保持系NJCMS5B,在不育系NJCMS5A的花芽中GmAMS基因的表达水平显著下调。组织化学染色结果表明GmAMS启动子驱动的GUS蛋白主要集中在转基因拟南芥的幼小花药中表达。研究结果为进一步探究GmAMS在大豆花发育中的生物学功能和调控机制奠定了基础。     

一个水稻钙调素结合蛋白基因OsCaMBP的克隆及表达分析

 通过荧光差异显示和RT PCR技术,克隆到一个新的水稻钙调素结合蛋白基因OsCaMBP。序列分析表明,该基因cDNA序列全长2094 bp,编码一个具有569个氨基酸残基的多肽,推测分子量为63.2 kD;在OsCaMBP蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象,与其他植物中的钙调素结合蛋白的相似性介于38.25%~47.28%。在热激处理15 min、30 min、 1 h或2 h后,该基因在水稻的叶、根和叶鞘中表达量急剧增加;此外,该基因表达量也受低温调控而增加。     

稻瘟病菌3—磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

以ＰＣＲ为基础结合ｃＤＮＡ库构建,分两段克隆稻瘟病菌的３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）分别测序,合并,获得该基因编码区全部１０１１ｂｐ的核苷酸序列,可以编码３３６个氨基酸和１个终止密码子ＴＡＡ。该序列与其它１２种丝状真菌的已知ｇｐｄ基因序列有着高度的同源性,它们的核苷酸序列同源性为６１．４％～８６．６％,氨基酸序列同源性为６４．６％～８６．３％,尤其在酶活性功能区,不同丝状真菌间有着近１００Ｔ     

苦瓜McAPX2基因及其启动子的克隆与表达分析

基于苦瓜叶片均一化文库克隆得到McAPX2基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KJ722767.1),采用染色体步移法获得该基因的启动子序列,实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同器官中的表达量及低温胁迫对McAPX2表达量的影响。结果表明:McAPX2基因全长1 086 bp,开放阅读框747 bp,编码249个氨基酸;McAPX2属于过氧化物酶家族ClassⅠ的成员,其脂肪族氨基酸指数为83.90,是一个亲水性蛋白,可推测定位于细胞质中;与甜瓜(NP_001284378.1)、黄瓜(ACO90193.1)、南瓜(AHF27424.1)、苦瓜(AGJ72851.1)同源性较高,分别为95%,94%,94%和93%;q RT-PCR结果显示,在苦瓜的根、茎、叶、雌花和幼果等组织器官中McAPX2的表达量存在显著差异,其中根的表达量最大,而在叶片中的表达量最低;在低温胁迫下,随着胁迫时间的延长,McAPX2表达量逐渐上调,处理12 h时达到最大,随后下降,说明该基因的表达与苦瓜耐低温胁迫相关。分离得到McAPX2基因上游调控序列1 267 bp,其启动子含有与GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物胁迫以及热激、干旱、低温、光等非生物胁迫的相关元件。     

一个水稻穗特异表达锌指蛋白基因的克隆与结构分析

利用生物信息学和RT PCR方法从水稻中克隆鉴定了一个新的具有TFⅢA型锌指结构的锌指蛋白基因,其开放阅读框为1092 bp,编码363个氨基酸残基。组织表达谱结果表明,该基因只在水稻幼穗组织中表达,在成株期的根、叶、茎以及花药中不表达,将其命名为OsZPT3 1。序列分析表明OsZPT3 1具有3个C2H2型锌指结构,在氨基酸的C端没有典型的转录抑制区域DLN box,但LXLXL的结构仍然表明OsZPT3 1可能是一个转录抑制因子。对OsZPT3 1启动子区域进行预测,结果发现3个MADS box转录因子识别位点,推测OsZPT3 1可能在MADS box转录因子的调节下,通过抑制下游基因的表达在水稻穗部器官的生长发育过程中发挥重要的调控作用。     

水稻抗感纹枯病品种Ospgip1基因的表达特征

 从水稻基因组DNA中扩增出1 184 bp的Ospgip1基因片段。该片段包含930 bp的完整开放阅读框,终止密码子为TAA,无内含子。RT PCR结果表明,Ospgip1基因在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达,但不同生育期、不同部位表达量有差异。实时PCR结果显示,抗病品种YSBR1和中感品种Jasmine 85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont;稻苗黄化处理后,无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达量均显著提高;纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加,而对感病品种影响不大。     

香蕉NPR1E基因的克隆及表达分析

NPR1基因可参与调节植物对病原菌的广谱抗性,在植物系统抗性中起着关键的调控作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系中获得NPR1E基因,命名为MaNPR1E(GenBank登录号分别为：KF582550)。MaNPR1E是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA,包含一个1 755 bp的最大开放阅读框,编码一个含584个氨基酸的蛋白质。经蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域,属于典型的NPR1蛋白。系统进化树比对分析表明,MaNPR1E与海枣PdNPR3(XP_008808341.1)和油棕EgNPR3(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,该基因组成型表达于香蕉各组织。实时荧光定量PCR分析表明,接种枯萎病菌后MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制,而在抗病品种中被激活;MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导。上述结果表明,MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病过程中扮演重要的调控角色。     

Cloning and Expression Analysis of a Mitogen-Activated Protein Kinase Gene OsMPK14 in Rice

Mitogen activated-protein kinases(MAPKs)are important components in signal transduction pathways responding to various biotic and abiotic stresses.An MAPK gene,OsMPK14(GenBank Accession No.GQ265780)from rice(Oryza sativa L.),was cloned by RT-PCR.The full-length cDNA of OsMPK14 consists of 1660 bp in size,containing an open reading frame of 1629 bp,which encodes a 542-amino-acid polypeptide and has a typical protein kinase domain and a phosphorylation activation motif TDY.Sequence alignment and analysis reve...     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列,命名为HbCaM1-7。序列分析结果发现,HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,HbCaM1-6间氨基酸同源性为100%,HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,HbCaM1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,HbCaM1-6在各组织中均有表达,除了HbCaM3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而HbCaM7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,HbCaM2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中HbCaM1-5圴呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

杜鹃红山茶ACO1的克隆及其表达分析研究

根据山茶（Camellia japonica）同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3°,5°-RACE技术,从杜鹃红山茶（C. azalea）花芽组织中克隆出ACC氧化酶（ACC-oxidase, ACO）基因,命名为CaACO1,基因全长1232 bp,开放阅读框963 bp,编码320个氨基酸。实时荧光定量PCR分析发现,ACO1在杜鹃红山茶不同组织中均得到表达,其中茎尖ACO1表达量最低,其次花芽、叶芽、根尖,表达量较高的是真叶和花器官,随着叶片成熟和花器官发育ACO1表达量均逐渐增加。结果表明,该基因可能参与杜鹃红山茶叶片发育,并且与花器官衰老密切相关。ACO1在参试的8个山茶品种花器官发育过程中的表达模式基本一致,但不同品种间的表达量存在差异。相关性分析发现ACO1表达量与花型、花色、花径和花瓣数4个形态指标均无显著相关性。     

巴西橡胶树生长素响应HbJAR1基因克隆与表达分析

JAR1基因是植物生长素响应基因,具有维持植物体内生长素浓度动态平衡和增强植物抗逆性的功能。为了阐明巴西橡胶树中JAR1基因的结构与功能,本研究利用Q-PCR技术在橡胶树CATAS7-33-97叶片中扩增了JAR1基因,其推导氨基酸含有JAR1蛋白特征性的GH3 superfamily结构域,无信号肽,无跨膜区域,定位在细胞质中,命名为HbJAR1。表达分析结果表明:该基因在橡胶树叶片中的表达量受光照强度、机械伤害和白粉菌侵染显著上调,吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、乙烯利(ET)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)对HbJAR1在橡胶树中的表达也起到不同程度的上调作用。表明HbJAR1基因属于植物JAR1家族,与橡胶树对光照、伤害等逆境响应有关。     

茶树GAGP基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得GAGP基因长3β146βbp（GenBank,登录号KJ946251）,具有2β769βbp开放阅读框（1^st~2β769^th）,编码923个氨基酸。分子生物信息学分析表明,GAGP蛋白分子量约106.9βkD,等电点为8.42,定位于线粒体内。定量PCR分析表明,GAGP在茶树叶片中表达强度存在明显的品种差异,GAGP对生物性和非生物性胁迫均有明显响应。     

Three Genes Related to Trehalose Metabolism Affect Sclerotial Development of Rhizoctonia solani AG-1 IA,Causal Agent of Rice Sheath Blight

Trehalose metabolism is related to the sclerotial development of Rhizoctonia solani AG-1 IA, the causal agent of rice sheath blight (RSB). Here, we further elucidated the functions of three genes Rstre, Rstps1 and Rstpp that encode three key enzymes trehalase (TRE), alpha, alpha-trehalose- phosphate synthase (TPS1) and trehalose 6-phosphate phosphatase (TPP) in the sclerotial development of R. solani AG-1 IA. Due to the lack of a stable genetic transformation system for R. solani, the heterologous expression of these three genes in Pichia pastoris GS115 was performed. The results showed that reactive oxygen species (ROS) contents and enzyme activities in R. solani decreased significantly in the treatments of the fermentation broths of Rstps1 and Rstpp transformants, and that in the treatment of the fermentation broth of Rstre transformant visibly increased. Furthermore, the fermentation broths of the transformants of all the three genes were added to potato dextrose agar (PDA) medium for the cultivation of R. solani, as a result, the dry weight of sclerotia in each PDA plate containing the fermentation broths of Rstps1 and Rstpp transformants significantly increased compared with the control, and that of Rstre transformant obviously decreased. Finally, 178 proteins were found to interact with RSTPS1, and 16 of them were associated with ROS. Taken together, the findings suggest that all these three genes related to trehalose metabolism play important roles in the sclerotial development of R. solani AG-1 IA, and can be used as new targets for the development of novel high-efficiency fungicides for the controlling of RSB.