水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

一个水稻铜锌SOD酶基因在应答亚砷酸盐胁迫中的作用

【目的】水稻Os08g44770.1基因编码一个铜锌SOD酶,但其在响应亚砷酸盐[As(Ⅲ)]胁迫中的生物学功能未知。本研究旨在深入揭示由该基因调控水稻砷耐性改变的分子机理并为水稻抗逆育种提供理论参考。【方法】以野生型日本晴(WT)和2个Os08g44770.1过表达转基因株系为试材,通过胁迫处理、生理指标测定和基因表达分析等,系统探究了转基因植株对As(Ⅲ)的耐受性表现,并初步揭示了其调控水稻砷耐性的生理和分子机理。【结果】与WT相比,过表达转基因株系对As(Ⅲ)更加敏感;转基因植株在砷胁迫下的根系相对伸长量、生物量(干质量)、叶绿素含量、根系细胞质膜完整性、叶片抗氧化程度等均显著低于WT;Os08g44770.1在砷处理后的WT和转基因植株叶片中的表达模式略有不同,但均表现为处理24 h时被显著诱导表达。【结论】过度表达Os08g44770.1基因可导致水稻的砷耐受性极显著下降。     

褐飞虱小分子量热激蛋白基因表达特性和功能

【目的】研究褐飞虱小分子量热激蛋白的表达特性和功能,明确其在褐飞虱温度胁迫适应中的作用。【方法】采用BLAST从转录组数据库中筛选褐飞虱小分子量热激蛋白基因序列;利用Bioedit、Mega等分子生物学软件进行序列分析;利用qPCR技术分析目的基因在不同处理下的表达特性;利用原核表达技术研究其功能。【结果】筛选到6个含有α-晶体结构的小分子量热激蛋白基因NlHsp20.9、NlHsp21.6、NlHsp21.9、NlHsp22.4、NlHsp23.1、NlHsp28.7,其ORF长度依次为561、531、570、570、588和735 bp,理论等电点为5.96、5.77、6.32、5.01、5.74和7.74。NlHsp28.7在3龄若虫中的表达量最高,而NlHsp21.9和NlHsp23.1在雌成虫中的表达量最高。雌虫在低温胁迫后所有小分量热激蛋白基因的表达量均下降,高温胁迫后除NlHsp22.4外的其他5个基因表达量不同程度上调;3龄若虫在低温胁迫后一半sHsps表达量下降,另一半上升,高温胁迫后全部上调。转化褐飞虱sHsps的重组大肠杆菌热激存活率显著上升。【结论】褐飞虱小分子量热激蛋白具有龄期和诱导表达特性及热胁迫保护功能,可能在其高温胁迫应激中具有重要作用,在低温胁迫应激中的作用与虫态有关。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

水稻OsENO2-2基因过表达对水稻抽穗期的影响

【目的】 OsENO2-2是OsENO2通过可变剪切产生的短转录本,其cDNA序列从粳稻中花11中分离获得。本研究的主要目的是初步分析OsENO2-2在水稻抽穗期调控中的作用。【方法】 构建了OsENO2-2的超量表达载体,获得转基因植株,通过对表型的观察和统计,分析目的基因在过量表达条件下的功能,并利用反向遗传学方法验证该基因的功能。【结果】 OsENO2-2过量表达导致水稻在长日照条件下的抽穗期推迟,而短日照条件下抽穗期无明显变化。通过qRT-PCR方法对水稻开花关键基因的检测发现,在长日照条件下,RFT1的表达量在超表达材料中显著下调,其他开花重要基因表达量在野生型和超表达材料中没有显著变化;而在短日照条件下,所有检测基因的表达量在野生型和超表达材料中均没有显著变化。【结论】 在长日照条件下,OsENO2-2主要通过调控RFT1基因的表达来调控水稻抽穗期。     

水稻幼穗响应稻曲病菌毒素胁迫早期的转录组分析

【目的】由稻曲病菌引起的稻曲病不仅造成水稻减产,而且还会产生对动物和植物有毒的真菌毒素。探明水稻幼穗对稻曲病菌毒素胁迫响应的分子机制,可为发掘水稻抗稻曲病基因以及抗病分子育种开辟新的思路。【方法】用稻曲病菌毒素处理水稻幼穗,采用转录组测序技术对水稻幼穗进行转录组测序,以水稻9311基因组作为参考基因组进行对比,利用TPM法计算基因表达量,设定参数（差异倍数的绝对值不小于2,且q值不大于0.05）筛选差异表达基因。结合基因差异表达分析、富集功能分析,鉴定水稻响应胁迫的关键基因,并利用实时荧光定量PCR技术对差异表达基因进行验证。【结果】在稻曲病菌毒素胁迫12 h后,水稻幼穗出现2526个差异表达基因（DEG）;通过GO富集、KEGG代谢途经和KOG功能分析,将差异基因划分为GO功能下的64个条目、32个代谢途径和KOG功能下23个类别,包括淀粉和蔗糖代谢、苯丙类生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢等生物学过程。DEG中有66个植物转录因子,分属7种植物转录因子家族,包括WRKY和Myb两大转录因子。分析二萜类生物合成与淀粉和蔗糖代谢途径相关基因发现,OsCPS2、OsKSL4和细胞色素P450等基因表达量上调,而淀粉酶、β-呋喃果糖苷酶和UDP-焦磷酸化酶等基因表达量下调,推测这些基因在水稻响应稻曲病菌毒素胁迫时发挥重要的作用。【结论】稻曲病菌毒素作为非生物胁迫因素对水稻幼穗具有毒性;通过干扰淀粉和蔗糖代谢等途径而影响种子营养物质的合成,降低水稻抵抗病原菌侵染水稻的能力。     

土壤施用生物质炭对取食水稻的灰飞虱生活史特征的影响

【目的】为评价土壤施用生物质炭在防治农作物害虫中的潜力,观察了土壤施用生物质炭对取食水稻的灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)发育和生殖的影响。【方法】开展室内盆栽试验,采用生物质炭种类(玉米、水稻和小麦秸秆)与添加量（0、30和50g/kg）的2因素×3水平组合处理土壤,种植水稻苗、接种灰飞虱,观察灰飞虱的发育和生殖表现。【结果】1)生物质炭种类与添加量互作影响灰飞虱若虫历期,当施用玉米或水稻生物质炭时,不同添加量之间的若虫历期无显著差异;当施用小麦生物质炭时,添加30g/kg生物质炭处理下的若虫历期比对照(18.70±0.30 d)延长1.54 d。2)生物质炭种类与添加量没有显著互作影响雌成虫寿命。添加量不影响,但生物质炭种类具有显著影响,施用玉米或小麦生物质炭处理雌成虫寿命比水稻生物质炭处理雌成虫寿命(23.70±0.48d)分别延长2.13 d或3.10 d。3)生物质炭种类与添加量互作影响灰飞虱雌虫终身产卵量,施用生物质炭使生殖力下降,但下降幅度随生物质炭处理不同而异,当添加30g/kg生物质炭时,施用玉米生物质炭处理下的雌虫终身产卵量(176.40±6.84粒)比施用水稻或小麦生物质炭处理分别多22.80粒或18.95粒;当添加50g/kg生物质炭时,施用玉米生物质炭处理的雌虫终身产卵量(140.30±3.26粒)比施用水稻或小麦生物质炭处理分别少16.90粒或21.60粒。【结论】施用生物质炭可减弱灰飞虱的生殖力,减幅随生物质炭种类与添加量的不同而异。     

茶多酚诱导铜绿假单胞菌交叉耐受性研究

检测了亚致死浓度的茶多酚（Tea Polyphenols,TP）处理对铜绿假单胞菌交叉耐受性的诱导作用。铜绿假单胞菌暴露于1βmg·mL^-1茶多酚1βh后能够显著增强细菌对多种环境条件的耐受性,包括氧化剂（1βmmol·L^-1 H₂O₂）、高温（47℃）,及酸性溶液[磷酸缓冲液（pH4.0）、含有有机酸（60βmmol·L^-1柠檬酸、60βmmol·L^-1乳酸、80βmmol·L^-1乙酸）的磷酸缓冲液（pH4.0）]。另外,通过荧光定量RT-PCR技术分析了茶多酚诱导下铜绿假单胞菌胁迫相关基因的表达情况。研究发现,茶多酚能够显著诱导铜绿假单胞菌氧化胁迫相关基因katB、sodM、ohr、lexA和recN的表达,以及热激蛋白基因dnaK、groEL、htpG、grpE和groES的表达。这些胁迫相关基因的表达很可能在细菌交叉耐受性形成过程中起到重要作用。以上研究结果表明,虽然茶多酚作为天然食品添加剂具有较高的安全性,但在实际应用过程中应充分考虑茶多酚诱导细菌交叉耐受性所导致的潜在风险,以优化食品保鲜策略。     

19%丙环·嘧菌酯SE与生物刺激素混合防治水稻后期综合性病害及增产效果

田间试验结果表明,“丙环·嘧菌酯+天然螯合硼钙”组合对水稻后期综合性病害有较好的控制作用及增产效果。在水稻分蘖末期、孕穗中期每667 m²连续使用19%丙环·嘧菌酯SE 50 mL+天然螯合硼钙50 mL后,对稻瘟病、稻曲病的防治效果分别高达95.1%和97.8%,极显著优于施用75%肟菌·戊唑醇WG 10 g和32.5%苯甲·嘧菌酯SC 30 mL的处理,且安全性好、增产效果明显。“丙环·嘧菌酯+天然螯合硼钙”组合在当前水稻生产上有较好的推广应用前景。     

水稻直链淀粉合成调控新基因Wx410的功能与效应分析

【目的】挖掘Wx新等位变异,明确Wx410新等位基因对稻米品质性状的影响。【方法】以Wx^lv、Wx^a和Wx^b等位基因为模板,利用PCR进行第10外显子第101位碱基的A-G单点突变,分别构建了不同Wx等位背景下的Wx410定点突变植物表达载体p EGFC-Wx^lv410、p EGFC-Wx^a410和p EGFC-Wx^b410,阳性对照组载体分别为p EGFC-Wx^lv、p EGFC-Wx^a和p EGFC-Wx^b。通过转化糯稻品种苏御糯,分析该位点的变异对稻米品质的遗传效应。【结果】花后7 d和14 d,转基因植株p EGFC-Wx^lv410,p EGFC-Wx^a410及p EGFC-Wx^b410的胚乳Wx基因表达量较各自的阳性对照材料无显著变化,而颗粒结合淀粉合酶活性极显著降低;转基因植株直链淀粉含量较野生型显著降低,而糊化温...     

水稻小穗簇生基因OsCL6的定位及候选基因分析

[目的]通过对水稻小穗簇生基因的定位与候选基因分析,为进一步克隆幼穗发育过程中缩短枝梗长度造成小穗簇生的功能基因奠定基础.[方法]以航天诱变育种技术处理常规优质稻品种粤农丝苗获得一个稳定遗传的小穗簇生突变体cl6为试验材料,与粤金银占构建F1、F2作图群体,对簇生基因进行定位,结合转录组测序对候选基因进行预测与评价.[...     

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

[目的]Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟.探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考.[方法]利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌...     

江苏近年育成粳稻新品种/系的稻瘟病抗性基因及穗颈瘟抗性分析

【目的】明确水稻品种携带的抗稻瘟病基育种应用价值,是利用抗病基因培育抗病品种控制病害流行的重要前期工作。【方法】利用功能标记分析了14个抗稻瘟病基因在江苏近年育成的195个粳稻新品种/系中的分布情况,并对其中158个品种和17份携带抗稻瘟病基因Pigm的高世代回交株系进行穗颈瘟接种鉴定。【结果】大多数品种携带2~5个抗病基因,但所有品种均不含有Pigm基因;Pib、Pita和Pikh基因在供试品种中的分布频率较高,均在45%以上,其余基因均在30%以内;Pid3、Pid2、Pia、Pb1在新育成品种中的出现频率明显高于审定品种。测试品种对穗颈瘟的抗性主要与3个基因显著相关,贡献率由高至低依次为Pia、Pi3/5/i和Pita;其中,Pia或Pi3/5/i与Pita间的聚合效应均显著高于各基因单独存在时的抗病效应,且以Pia和Pita间的聚合效应最强,携带该基因组合的所有品种对穗颈瘟均表现抗至高抗水平抗性。回交导入Pigm基因的所有17份株系对穗颈瘟的抗性均显著高于各自轮回亲本,且均达到了抗病以上水平。【结论】抗病基因Pigm及基因组合“Pia+Pita”在江苏粳稻抗穗颈瘟育种中具有重要的育种应用价值。     

水稻富含半胱氨酸类受体激酶家族基因对纹枯病菌和植物激素的响应特征分析

[目的]明确水稻富含半胱氨酸类受体激酶(Cysteine-rich receptor-like kinases,CRK)家族基因对纹枯病菌侵染和植物激素的响应特征,是解析CRK在水稻纹枯病抗性中的功能的重要前期工作.[方法]利用生物信息学方法构建了水稻45个CRK的系统发育树,并利用qPCR分析了它们对纹枯病菌和对植物...     

甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析

黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase,F3H）是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶。本研究基于前期转录组数据,以‘福菜薯7-6’叶片为材料成功克隆CDS序列长度为1107 bp的基因IbF3H,利用生物信息学分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列对比、蛋白系统进化树、蛋白的二、三级结构、预测其跨膜结构和亚细胞定位,并利用qRT-PCR分析盐旱胁迫处理下基因的表达特性。结果表明,该基因含有3个外显子和2个内含子,编码368个氨基酸,蛋白分子量为41.12 kDa,等电点为5.83。存在多种类型的启动子顺式作用元件,如光响应元件G-Box、ACE,干旱胁迫相关的MBS元件,与脱落酸激素响应相关的ABRE元件等。与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上,可见IbF3H的编码区高度保守,且黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。IbF3H蛋白含有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶结构域）,属于双加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在细胞质中表达并且不具备跨膜结构。qRT-PCR研究结果表明,IbF3H基因并非组织特异性表达的基因,叶和茎表达量高于茎尖和根。模拟盐胁迫处理后,IbF3H基因表达量呈现先下降后上升的趋势;模拟干旱胁迫处理后,IbF3H基因表达量始终高于对照组,以响应逆境胁迫。本研究可为下一步探索IbF3H基因在调控甘薯类黄酮生物合成途径和功能作用奠定基础。     

甘蔗近缘野生种蔗茅EfGRAS基因克隆及表达分析

为深入挖掘甘蔗品种的抗旱性能,本研究挑选甘蔗品种中参与调控抗旱机制的主要转录因子GRAS的基因进行表达分析。从转录组数据库中调取GRAS转录因子基因序列信息,采用RACE-PCR和qRT-PCR技术从‘蔗茅99-2’中克隆得到1个GRAS基因,将其命名为EfGRAS（GenBank登录号MT499789）,并对其进行生物信息学分析与干旱胁迫表达分析。结果表明,EfGRAS基因编码547个氨基酸,CDS全长1644 bp,该蛋白的分子式为C₂₆₄₅H₄₁₄₉N₇₄₇O₈₁₆S₂₁,相对分子质量为60.14 kDa,不稳定系数为54.85,脂肪系数为84.37,GRAVY值为?0.293,是一类不稳定蛋白和亲水蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,EfGRAS蛋白主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲,与高粱亲缘关系最近;qRT-PCR分析显示,受到干旱胁迫后,‘蔗茅99-2’中基因表达量相比于对照组上调约57.6倍,‘滇蔗01-58’中基因表达量相比于对照上调约27.4倍,‘崖城89-9’中基因表达量相比于对照组上调倍数较低。本研究结果为进一步研究EfGRAS基因在甘蔗中的功能提供理论基础。     

水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能。【方法】对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522^Dof6-3和9522^Dof6-4。对突变体T₁株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d。实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。     

氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟中肠细菌类微生物的多样性

目的 明确氯虫苯甲酰胺处理下二化螟中肠细菌类微生物多样性的变化。方法 综合运用宏基因组测序以及传统微生物分离纯化的方法分析不同浓度氯虫苯甲酰胺处理的二化螟种群中肠微生物的多样性。结果 不同浓度(100、200、400µg/mL)氯虫苯甲酰胺处理后二化螟中肠细菌类微生物丰度及多样性降低,处理种群中肠细菌类微生物的OTU数值、特有的OTU数值均低于对照;摩根氏菌属(Morganella)、普罗威登斯菌属(Providencia)以及变形菌属(Proteus)在处理种群中的比例明显升高;同时培养结果显示氯虫苯甲酰胺处理种群获得的菌株除肠杆菌属(Enterobacter)外,还存在超压莱略特氏菌(Lelliottianimipressuralis)、非脱羧勒菌(Leclerciaadecarboxylata)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)等其他菌属。COG数据库对比与KEGG分析显示,对照与处理二化螟种群的各功能分类基因数量及相对丰度无明显差异。结论 解析了氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟中肠细菌类微生物的多样性。这些结果为进一步研究中肠细菌在二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗药性奠定基础。