藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

绵羊朊蛋白PrP~C51-216蛋白酶K抵抗片段的克隆原核表达及纯化

根据绵羊朊蛋白基因(prion protein nucleic acid,PrNP)序列,截去PrNP部分N端信号肽(150 bp)和C端GPI锚定位点(123 bp)形成PrNPT-08,设计特异性引物,以绵羊全血提取DNA为模板,扩增PrNPT-08序列。与表达载体pET30a(+)连接,转化入BL21(DE3)感受态细胞。用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE电泳、纯化、Western blotting验证。结果表明,所插入的克隆片段含有498个核苷酸,共编码166个氨基酸,序列对比分析表明,与GenBank中绵羊朊蛋白基因序列同源性为99.6%,氨基酸序列同源性为98.8%。PrNP T-08基因在大肠杆菌得到高效表达,表达产物为相对分子量为27 kDa的融合蛋白,并能被PrP单克隆抗体AH6所识别。该蛋白成功表达为研究朊蛋白生理生化功能和结构转变提供了基础生物学材料,同时为朊蛋白疾病诊断中所需单克隆抗体的制备提供基本的试验材料。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白（PrP）基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽（九肽）重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸（除LT200302为23个氨基酸外）的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物，采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因，序列分析结果表明，所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678bp、编码226个氨基酸的前体蛋白，其核苷酸序列的同源性为99．79％以上，发现了4个核苷酸多态性位点，无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较，与猫（AF003087，96．7％）和绵羊（96．2％）的氨基酸同源性最高。     

处理重组牛朊蛋白对接种金黄地鼠脑组织朊蛋白的效应

将纯化的重组牛朊蛋白经理化因子处理后,脑内接种金黄地鼠。临床观察200天后,对大脑、小脑和脑干,进行蛋白酶抗性朊蛋白的WesternBlot检测和朊蛋白基因表达绝对定量。结果表明,处理的重组牛朊蛋白对金黄地鼠脑组织检测部位的基因表达有特定的影响;接种后在检测时间内处理重组牛朊蛋白没有导致金黄地鼠脑内酶抗性朊蛋白的出现。研究结果为重组朊蛋白的生物学提供了基础数据。     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5（MSP5）基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因.将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析.结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp.将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体.将其转化到DH5a宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku.Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别.     

大肠杆菌多药耐药基因AcrA的克隆及其原核表达

从大肠杆菌AcrA的编码序列中设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，扩增出AcrA基因中约691bp的cDNA片段，将所得片段与pMD—18T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经HindⅢ和BamHI酶解，回收691bp的目的片段，定向克隆到pET—28a表达载体中，提取质粒，再次转化到BL21(DE3)中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS—PAGE检测出AcrA部分基因的表达。     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

羊朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从6只羊（3只藏绵羊和3只山羊）全血中提取基因组总DNA，用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因，并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，为包含在单一外显子内的完整开放阅读框，其与国外报道的已知序列基本相同。所克隆的羊PrP基因含5个短而富含G-C的元件，可编码八肽Pro—His—Gly—Gly—Gly—Trp-Gly—Gln或九肽Pro—Gln／His—Gly—Gly—Gly-Gly—Trp—Gly—Gln。这些PrP基因序列相比较，其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99．0％～100．0％和98．1％～100．0％之间。共发现17个碱基替换，其中6个为同义码替换、11个为异义突变。异义突变中，除SY200301～SY200303的S240P和MY200301的M112T外，其余均位于PrP氨基酸125～228的C-端球形结构区，分别为MY200301的G129S突变、MY200302的T191R突变、MY200303的G127S突变及SY200302和SY200303的H143R和R211G。6个羊PrP基因均为密码子136、154和171的PrPARQ等位基因。     

PrP基因在金黄地鼠淋巴和外周组织中表达水平的动态检测

利用实时荧光定量RT—PCR技术，构建了标准重组质粒，制备了标准曲线，对不同年龄金黄地鼠腹股沟浅淋巴结、脾、心、肝、肺和肾提取总RNA，反转录后进行PrP基因的表达定量。结果发现，淋巴组织呈现高的表达量，外周组织的表达量比较低；不同组织在不同年龄出现表达高峰。     

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因保守结构域所在片段的克隆及原核表达

为了克隆和表达编码扩展莫尼茨绦虫无精症缺失(DAZ)基因,试验根据GenBank中扩展莫尼茨绦虫DAZ基因cDNA序列(登录号为GH291478)设计1对特异性引物,以扩展莫尼茨绦虫组织总RNA为模板,RT-PCR扩增DAZ基因,并克隆到pMD19-T载体中进行序列测定,构建重组质粒pET28a-DAZ,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析表达产物,通过螯合琼脂糖凝胶FF亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明:重组DAZ基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白分子量约为14 ku。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

鹅细小病毒VP1与VP3非重叠序列的克隆与原核表达

根据鹅细小病毒GPVH1株基因组核苷酸序列设计了一对引物，对其结构蛋白VP1与VP3非重叠核苷酸序列进行PCR扩增，并克隆到表达性载体pGEX-6p-1，经酶切鉴定筛选出阳性克隆，并转化到大肠杆菌BL21(ED3)plysS进行原核表达，并用SDS—PAGE鉴定，结果表明融合蛋白在表达性细菌BL21中重获得了高效表达。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。