两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5′-端长末端重复序列(5′-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5′-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5′-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿...     

猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具.     

新城疫病毒感染性克隆全长cDNA转录载体的构建

以pEGFP-N1和pAdTrack-CMV质粒为模板,通过PCR扩增分别获得GFP基因序列和Kan基因序列;以胶回收的目的序列为模板,通过Overlap PCR扩增获得GFP-Kan基因序列.回收GFP-Kan基因序列,插入至pCI-neo载体上,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-GFP/Kan.再将设计合成...     

嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。     

禽白血病病毒A亚群分离株感染性克隆的构建

为探究A亚群禽白血病病毒(ALV-A)的致病机理,对本实验室分离到的一株命名为HB2015012的ALV-A进行感染性克隆构建。采用PCR方法将基因组分为重叠的3段分别扩增该分离株的cDNA,经酶切按顺序连接至pTOPO-Blunt Simpie构建重组质粒TOPO-012-ABC,进而转染易感的DF-1细胞,进行病毒的拯救。经禽白血病抗原检测试剂盒检测,PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定,均表明拯救出了具有感染性的重组A亚群禽白血病病毒(rALV-A),命名为rHB2015012。     

猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具.     

猪圆环病毒2型感染性DNA的构建及病毒拯救

用PCR法扩增猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)全长基因组。将全基因组插入到真核生物表达载体PcDNA3.1的多克隆位点中,获得单拷贝重组质粒P-PCV2和串连双拷贝重组质粒p-2PCV2,将所得质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系,经7次连续传代后,间接免疫荧光试验显示在细胞中含有病毒抗原。提取mRNA后经RT-PCR检测都有PCV2特异性基因转录。免疫小鼠后,对免疫后不同天数小鼠的血清用ELISA检测,结果到免疫后35 d病毒几乎都能检测到衣壳蛋白特异性抗体,小鼠致死后在其体内也能检测到病毒DNA。结果表明,所构建的2种重组质粒均可表达并在体外组装出有感染性PCV2病毒粒子。为进行PCV2分子特性、疫苗免疫及致病机理研究打下了基础。     

禽白血病病毒K亚群HB2018003株感染性克隆构建

为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒K亚群(ALV-K)毒株,对地方性ALV-K毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救.使用PCR方法获得目的 基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-003-K12,测序结果表明无任何突变,进而将重组质粒转染...     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆,采用PCR方法从已鉴定为PCV2阳性的病料中扩增PCV2全长基因组片段后将其定向克隆至PVAX1载体中,构建了PCV2感染性克隆质粒p VAX1-PCV2;将重组质粒转染细胞进行病毒拯救,通过免疫过氧化物酶和RT-PCR进行拯救病毒检测,并初步测定了拯救病毒在体外细胞培养的增殖能力和遗传稳定性。结果表明,构建的PCV2感染性克隆质粒,成功拯救出PCV2,拯救病毒盲传8代后毒价可达104.78TCID50/m L,体外增殖能力较为稳定。本试验为深入研究PCV2的基因功能及致病机制等奠定基础。     

鹌鹑对新城疫病毒的易感性试验

用从新城疫病死鹌鹑中分离的新城疫病毒(NDV)株(QNDV-1)和鸡新城疫毒株(F_(48)E_8),对5日龄、10日龄、25日龄、35日龄和70日龄等不同日龄鹌鹑进行了感染试验,并用15日龄鹌鹑做了呼吸道、肌肉注射、皮下注射、脑内注射、静脉注射和消化道等不同途径的感染试验。结果表明:供试不同日龄鹌鹑均可被感染发病,并出现和自然病例同样的症状或死亡,随着日龄增长,死亡率有降低趋势,70日龄鹌鹑(成年产卵)出现同自然病例同样的产卵量下降和产出异常卵现象;不同途径均可使鹌鹑感染发病或死亡,其中以脑内注射和静脉注射所表现的发病或死亡最为急剧;从病死鹌鹑中可重新收回到新城疫病毒,发病耐过鹌鹑可产生特异性抗体。     

新城疫病毒特异性糖蛋白基因探针的制备及应用

应用ＲＴ－ＰＣＲ获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的部分囊膜糖蛋白基因片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为９２６ｂｐ,与预期结果相符;将该基因片段定向克隆入质粒载体ＰＵＣ１９只,得到重组质粒Ｐ９２６,酶切分析结果与已发表的ＮＤＶ毒株酶切位点一致。     

一株鸭源新城疫病毒强毒株的分离与初步鉴定

从表现腹泻、神经症状、肠道粘膜局部出血、坏死以及卵泡充血、出血为特征的病死产蛋鸭分离到一株病毒,经血凝（hemagglutinin,HA）、血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）和血清中和试验（seium neutralization,SN）及部分融合蛋白（F）基因的序列测定初步鉴定为新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）,命名为JSD0812株。该毒株10日龄SPF鸡胚平均死亡时间（mean deathtime,MDT）为54．6h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数（intracerebral pathogenicity index,ICPI）为1．75,6周龄SPF鸡静脉接种指数（intravenous pathogenicity index,IvPI）为2．68,其F蛋白裂解位点氨基酸序列为^112R—R—Q—K—R—F^117,上述结果符合NDV强毒株的分子特征,证实该毒株为NDV强毒株。致病性试验表明该毒株对鸡、鸭和鹅均有很强的致病性．     

CpG寡核苷酸增强鸡新城疫疫苗免疫效力的研究

为了探讨CpG寡核苷酸（CpG oligonucleotide,CpG ODN）对鸡新城疫疫苗免疫效力的影响,将CpG2007与鸡淋巴细胞共孵育,测定淋巴细胞增殖率,结果发现CpG2007对鸡淋巴细胞具有显著的刺激活性。将CpG2007与不同浓度的新城疫抗原混合,制备灭活疫苗,免疫健康雏鸡。分别于免疫后不同时间采血,测定抗体效价和细胞因子表达量,并进行攻毒保护试验。结果发现,添加CpG ODN佐剂的试验组均比对应相同抗原剂量的免疫对照组的抗体水平高,产生抗体速度快;抗原剂量降低10倍的佐剂试验组与高抗原剂量免疫对照组抗体水平和攻毒保护率均相当,表明CpG ODN能显著增强新城疫疫苗的免疫效力,能促进机体产生更强烈的免疫应答,是有效的疫苗佐剂候选物质。     

ClassI新城疫病毒强毒株融合蛋白的表达时相分析

根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列,设计特异性引物扩增融合蛋白（F）基因截短片段（199～1500nt）,利用原核表达获得重组蛋白,切胶免疫Balb／c小鼠,制备特异性多抗血清,利用制得的血清进行F蛋白表达时相分析。结果表明：NDV9a5b病毒按5M．0．1（multiplicityofinfection,多重感染复数）感染量接种DF1单层细胞,经IFA检测,在感染6h时,F蛋白开始出现,主要分布于细胞浆内;12～16h胞浆申的F蛋白含量逐渐增多,形成包涵体,开始在细胞膜上分布;当病毒感染24h后,F蛋白在细胞膜上形成明显的膜周染色;至感染36h后,出现多个细胞融合的包涵体,细胞已基本崩解。此时,F蛋白也散在分布于包涵体中。这为深入开展F蛋白与该病毒的毒力演化机制研究工作奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒上海株的分离与鉴定

本研究对分离自上海某养鸡场的疑似鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)进行了分离和鉴定.所采用的方法有:鸡胚致病性试验、对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的干扰试验、动物回归试验以及RT-PCR鉴定等.试验结果表明,该病原接种鸡胚后,48 h可引起鸡胚死亡,胚体呈侏儒样变化,对NDV感染有明显干扰作用;用分离的病毒接种SPF雏鸡可产生明显呼吸道症状,肾脏表现肿大和大量尿酸盐沉积等病理变化;用IBV特异性引物可以从分离物中扩增出IBV的N基因序列,测序结果表明,该毒株属于肾型IBV.综上所述,本研究在上海流行区域成功分离到一株IBV,将其命名为SH11株.     

1日龄火鸡新城疫LaSota苗与灭活苗联合接种后的免疫应答

火鸡１日龄时用新城疫ＬａＳｏｔａ苗与油乳剂灭活苗联合免疫后，在７、１４、２１、３５日龄及攻毒后，检测了火鸡免疫器官组织法氏囊、胸腺、脾脏、盲肠扁桃体、哈德尔腺中浆细胞、ＴＡＮＡＥ＋＿数量变化。结果表明：免疫火鸡法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体、哈德尔腺的浆细胞明显增多，机体体液免疫应答显著增强；胸腺、脾脏、盲肠扁桃体、哈德尔腺中ＴＡＮＡＥ＋也程度不同地增多，细胞免疫应答也明显增强，免疫后６０ｄ，用新城疫苗强毒攻击，免疫火鸡获得了良好的保护。     

传染性法氏囊病病毒强毒株HB／11的分离与鉴定

2011年8月,从河南省疑似传染性法氏囊病鸡群采集病料,通过鸡胚接种、琼脂扩散试验和RT-PCR等方法,证实分离的病毒为传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV）,命名为HB／11株。序列分析表明,HB／11株VP2基因的核苷酸序列与GenBank中发表的部分国内外IBDV超强毒株VP2基因序列相似性在99％左右;HB／11株VP2高变区基因含有七肽基序为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。动物回归试验表明,30日龄鸡群接种该毒株后引起鸡群发病率为100％,死亡率为70％,剖检可见鸡传染性法氏囊病典型病变。因此该病毒为IBDV强毒株。     

新城疫病毒弱毒骨架表达强毒F基因的重组病毒生物学特性研究

为了解目前中国新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）优势基因VIId型的毒力机制,应用反向遗传技术将我国优势流行基因VIId型强毒株I4的F基因替换弱毒LX的F基因,获得表达NDV强毒株I4F基因的重组病毒NDV/LX-If。测定重组病毒的致病指数和组织分布,结果发现,重组病毒NDV/LX-If毒力比骨架病毒有了显著的提高。NDV/LX-If的鸡胚平均致死时间（mean death time,MDT）为56 h,雏鸡脑内接种致病指数（intracebral pathogenicity index,ICPI）为1.49,属于中等毒力,毒力比亲本病毒毒力低,但都能使自然途径感染的鸡100%死亡,同时获得了亲本毒株的组织嗜性。可见,新城疫病毒F基因是毒力和组织嗜性的主要决定因素,但是其它基因对新城疫病毒的毒力也可以产生影响。     

2006～2008年华东地区新城疫病毒HN基因序列分析

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的HN（血凝素-神经氨酸酶,hemagglutinin—neuraminidase）基因分子流行病学规律,利用RT—PCR扩增了2006～2008年间分离自我国华东地区的43株NDV的HN基因片段。基因序列分析显示,分离株中基因Ⅰ型2株,基因Ⅱ型3株,基因Ⅵ型1株,其它37株都属于基因Ⅶd亚型。根据遗传发生进化树可将基因Ⅶd亚型进一步分为Ⅶd1和Ⅶd2两个亚型,基因Ⅶd1亚型HN蛋白的第102、118、443位氨基酸分别为T,A和T,而基因Ⅶd2亚型则分别为I,E和M。另外,研究表明HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势。