副溶血弧菌毒力因子的研究进展

全球食源性疾病案例呈现逐步上升的严重趋势,而作为沿海地区的首要食物中毒病原菌,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)已经成为引起微生物性食源性疾病之首。本文主要就副溶血弧菌常见的毒力因子的分布和致病机制的研究进展进行详细阐述,对制定该菌引发的食源性疾病的解决方案并有效控制该病原菌的传播扩散具有非常重要的意义。     

盐碱水体副溶血弧菌的分离和鉴定

为了明确副溶血弧菌在内陆淡水水体中的分布情况,本试验从查干湖水体中分离得到1株革兰阴性杆菌,命名为A201805S2,对其进行形态观察、生理生化鉴定,并利用PCR方法对其16S rDNA基因序列进行扩增和测序,将测得结果于NCBI上进行BLAST同源性比较。结果显示,该菌株在硫化硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)上为绿色菌落,革兰染色呈红色,两端钝圆,为革兰阴性杆菌;生理生化鉴定结果与副溶血弧菌特性相一致;分离菌与副溶血弧菌16S rDNA基因序列同源性达99%。结果表明,本试验首次从内陆苏打盐碱型淡水水体中分离出副溶血弧菌,为淡水水体副溶血弧菌防控提供数据支持。     

海产品中副溶血弧菌的分离与鉴定

副溶血弧菌（Vibrio Paraaemolyticus)是一种致病性嗜盐菌，常引起人类食物中毒，通过对四种不同海产品的检测，发现该菌检出率很高，其中，海虾中的检出率高达90％，海产鱼为70％，贝类为60％，海蟹为40％，平均检出率为65％，动物试验证实，该菌致病性较强。     

副溶血弧菌耐热性直接溶血素的研究进展

副溶血弧菌是存在于海洋水体及海洋生物的致病菌,同时也是引发人食物中毒的重要因素之一。其主要的致病因子是溶血素,其中耐热性溶血素被认为是致病性副溶血弧菌的主要毒力因子。本文就副溶血弧菌耐热性直接溶血素的研究进展作一综述。     

用PCR检测副溶血性弧菌耐热溶血基因

根据副溶血性弧菌的耐热血素基因设计了２对引物、经聚合酶链式反应检测，所有１８株神奈川试验阳性副溶血血性弧菌均呈阳性反应，而６株神奈川试验阴性副溶血性弧菌呈阴性反应，其中９种弧菌和８株其他革兰氏阴性菌也呈阴性反应。     

创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立创伤弧菌和副溶血弧菌的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,本试验以创伤弧菌metalloprotease基因和副溶血弧菌ompA基因为靶点设计LAMP扩增引物,并在内引物间添加不同的酶切位点,通过对反应时间和温度的优化及酶切反应,成功建立了双重LAMP检测方法,并对其检测特异性、灵敏度和实际应用性进行了研究。结果显示,62℃反应45min时可同时检测到2种弧菌的存在,通过限制性内切酶酶切,可准确区分2种弧菌。该方法比普通PCR检测方法灵敏度高102~103倍。选择17株细菌菌株作为检测模板,发现除创伤弧菌和副溶血弧菌反应结果呈阳性外,其他均为阴性。以大菱鲆作为实验动物,检测双重LAMP技术的实际应用可能,该方法可准确检测并鉴定出组织和血液中感染的细菌种类,其灵敏度可达374~410CFU/g(mL)。SYBR GreenⅠ是一种结合于DNA双链小沟中的荧光染料,反应产物加入该染料后,极易用肉眼判别。本试验成功建立了创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法,该方法可用于水产养殖中病原菌的早期诊断。     

噬菌体防治副溶血弧菌感染研究进展

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）不仅是我国水产养殖中引发细菌性疾病的重要病原菌,也是引发水产品食源性疾病的重要致病菌。近年来,噬菌体（bacteriophage）作为抗生素替代品在防治细菌性疾病方面的研究得到广泛关注,未来可能是破解抗生素滥用导致的微生物耐药难题的新型生物制剂,具有广阔的应用前景。噬菌体具有高度宿主特异性和宿主菌依赖性,可有效控制软体动物、甲壳类动物、鱼类动物副溶血弧菌感染;结合基因工程技术、鸡尾酒疗法可解决噬菌体在防治副溶血弧菌感染中的一些不足,但噬菌体安全风险仍需进一步评估。今后,深入研究噬菌体的结构与功能,揭示噬菌体与宿主之间相互作用关系,是推动噬菌体应用于生产实践的重要基础;优化噬菌体鸡尾酒疗法、噬菌体基因编辑等,将成为噬菌体治疗研究领域的重要方向。噬菌体将为水产养殖绿色发展和生物安保提供重要技术手段。     

副溶血弧菌海产品分离株及临床分离株的多位点序列分型

选取毒力调控基因toxRS和看家基因gyrB、recA作为靶基因,对浙江沿海地区40株副溶血弧菌海产品分离株与8株临床分离株进行多位点序列分型。toxRS的多态性位点比例(10.2%)虽低于gyrB(12.0%)与recA(25.4%),但与gyrB均可分辨出最多的序列型(38),具有最强的分辨力(0.986)。3个基因串联后可分出44个序列型,分辨力达0.994。副溶血弧菌分离株呈现出较大的多样性。各地的海产品分离株分布于A群、B群,而临床分离株则主要集中于A群;C群仅包括1个临床分离株。其中临床分离株C2、C5、C7与海产品分离株F24属于同一个序列型,由此可推测该序列型在地域上分布较为广泛并可引起人发生胃肠炎等。因而副溶血弧菌所引起的对公共卫生的潜在风险性不容忽视。     

副溶血弧菌和溶藻弧菌双重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时快速检测海产品中的副溶血弧菌(VP)和溶藻弧菌(VA)的双重PCR方法,本研究根据VP和VA的toxR基因序列设计针对这两种细菌的两对特异性引物,建立能够快速同时检测这两种细菌的双重PCR方法,并对该反应体系的特异性和灵敏度进行检测。结果显示纯培养细菌VP和VA的检测灵敏度分别为2.32×103cfu/mL和2.56×103cfu/mL,临床病料检测灵敏度分别为2 cfu和3 cfu;与枸橼酸杆菌、沙门氏菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌无交叉反应。研究表明本实验方法操作简便快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,并且经济实惠,值得推广应用。     

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药性

为查明副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus, Vp)对广西凡纳滨对虾( Litopenaeus vannamei )的危害及耐药情况,用常规方法对凡纳滨对虾病样进行细菌分离,API 20NE和16S rRNA对病原菌进行鉴定,K-B纸片扩散法进行药敏试验。结果显示,从160份发病凡纳滨对虾肝胰腺中共分离到67株副溶血弧菌,总检出率为41.88%。67株副溶血弧菌彼此之间高度同源,其相似度达99.2%~100%,与标准副溶血弧菌ATCC17802(GenBank登录号:NR114632.1)相似度为98.8%~100%。67株副溶血弧菌对28种试验抗生素中的氟苯尼考等12种药物表现出很强的敏感性,敏感率均在80%以上;对青霉素G等5种抗生素表现出很强的耐药性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫广西株的分离与鉴定

目的建立一种简单、实用的单卵囊分离方法，并对一株广西柔嫩艾美耳球虫进行分离。方法采用电泳制胶槽来制作琼脂块进行球虫单卵囊的分离，单卵囊实验感染9只1日龄雏鸡，感染后收集粪便，用饱和盐水漂浮法进行卵囊检测。纯种卵囊经口感染10只1日龄雏鸡，观测卵囊寄生部位、最短孢子化时间，以及其潜在期和排卵高峰期。结果2只雏鸡粪便中检出卵囊，单卵囊感染成功率为22％。通过对其中一株球虫的研究，根据其卵囊的形状、大小、寄生部位、潜在期、卵囊最短孢子化时间、排卵高峰期等生物特征，鉴定该株球虫为柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）。结论本研究成功建立一种单卵囊分离技术，可作为球虫单卵囊分离的常规方法。     

1株番鸭源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力基因分析

为查清引起滁州地区某养殖场雏番鸭死亡原因,本研究通过对分离细菌的鉴定和动物致病性试验,确定奇异变形杆菌是引起此次雏番鸭发病的病原体,并将分离的奇异变形杆菌命名为AHcz-1株.根据其16S rRNA基因序列,建立其遗传进化树;根据已报道的8个毒力基因ureC、zapA、mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、atfC序列,设计引物进行PCR扩增,并对毒力基因进行序列分析.结果显示:AHcz-1株与日本株(AB932526.1)亲缘关系最近,同源性高达100%;毒力基因pmfA、atfA、ureC均未发生变异;AHcz-1株具有较强的致病性;致病菌对丁胺卡那高度敏感,对庆大霉素、恩诺沙星中度敏感,对其它17种抗生素不敏感,表明AHcz-1株具有多重耐药性.本研究为番鸭源奇异变形杆菌临床诊断、临床用药及遗传变异研究奠定了基础.     

传染性法氏囊病病毒强毒株HB／11的分离与鉴定

2011年8月,从河南省疑似传染性法氏囊病鸡群采集病料,通过鸡胚接种、琼脂扩散试验和RT-PCR等方法,证实分离的病毒为传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV）,命名为HB／11株。序列分析表明,HB／11株VP2基因的核苷酸序列与GenBank中发表的部分国内外IBDV超强毒株VP2基因序列相似性在99％左右;HB／11株VP2高变区基因含有七肽基序为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。动物回归试验表明,30日龄鸡群接种该毒株后引起鸡群发病率为100％,死亡率为70％,剖检可见鸡传染性法氏囊病典型病变。因此该病毒为IBDV强毒株。     

绵羊肺源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究

为了查清新疆石河子部分规模场引起羔羊死亡的原因,本研究对采集的病羊肺脏组织进行细菌分离,同时对分离菌株进行小鼠致病性试验、特异性基因PCR检测、药物敏感性试验和耐药基因PCR检测.结果显示:从病变肺脏组织分离得到10株细菌,分离菌为大肠杆菌,致病性强;分离菌株呈现多重耐药现象,对诺氟沙星、复方新诺明、氟苯尼考等17种抗生素耐药;检测到iutA、fyuA、ireA、hlyD和afa 5种毒力因子,strA、strB、aadA1/aadA2、Bla(TEM1)、Bla(OXA1)、Tet A和Tet B 7种耐药基因.本研究为该地区规模场绵羊感染大肠杆菌的防控和临床用药提供依据.     

1株NADC30-like重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

为研究山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行病毒株的遗传变异情况,本研究从山东省威海市某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的猪肺脏组织中分离到1株PRRSV,命名为SDwh,并对其进行了全基因组序列测定、遗传演化分析和重组分析.结果显示:该病毒株在Marc-145细胞上生长良好,可见明显细胞病变;全基因组演化分析和同源性比对分析结果显示,SDwh株与美国病毒株NADC30和中国的NADC30-like位于同一分支;与北美病毒株NADC30的同源性最高,为93.1%;与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401、JL580的同源性分别为91.1%和88.4%;与北美经典病毒株VR2332、中国HP-PRRSV JXA1和HuN4的同源性均为85.3%;与欧洲型病毒株Lelystad-virus(LV)同源性最低,为60.6%.与VR2332相比,Nsp2氨基酸序列比对结果显示,SDwh株存在NADC30-like病毒株典型的131个不连续氨基酸的缺失,同时在584~585位缺失2个氨基酸;GP5氨基酸序列比对结果显示,SDwh在GP5抗原表位上有氨基酸的突变.全基因组重组分析结果显示,SDwh株是一株重组病毒株,为NADC30与JXA1-P80的重组病毒,潜在的重组位点位于Nsp2中(2066 nt).本研究结果为PRRSV流行株的重组、演化分析和防控提供借鉴意义.     

水貂绿脓杆菌的分离与鉴定

2011~2013年间,从山东省、河北省和江苏省等地的多个貂场疑似水貂出血性肺炎病貂的肺脏、肝脏和脾脏中分离到425株疑似绿脓杆菌。用绿脓杆菌的OprF和PEA基因的PCR引物对分离菌株的目的基因扩增,经核苷酸测序确定其均为绿脓杆菌序列。通过日本生研株式会社血清学分型系统进行分型：G型376株,占88.5%;B型34株,占8%;C型12株,占2.8%;E型3株,占0.7%。取其中6株细菌（G血清型3株,其他血清型各1株）进行详细生化试验,结果显示该6株菌均符合绿脓杆菌的生化特性,并且从这6株中选4株细菌（每血清型各1株）腹腔接种小白鼠和气管内接种水貂,结果表明4株菌对其均有致病性。     

结核变态反应阳性牛的非典型性分枝杆菌的分离与鉴定

本试验从６９头结核变态反应阳性牛中采取病料２０２份进行分枝杆菌，特别是非典型分枝杆菌的分离与鉴定，共获２６株分枝杆菌，除５株分枝杆菌外，其它全是非典型分枝杆菌。在这些非典型分杆杆菌中，５株偶发分枝杆菌，６株瘰疠分枝杆菌，５株鸟－胞内分枝杆菌，２株副结核分枝杆菌和１株ＲｕｎｙｏｎⅡ群。从病料看，有病变的分离率为４１．２％，无病变的为７．１％。在三种淋巴结病料中，以肠系膜淋巴结的分离率为最高，颌下淋巴     

国内火鸡体内霉形体的分离与鉴定

从北京和呼和浩特市4个火鸡场的95只火鸡、50只火鸡胚和42份精液样品中分离到15个分离物,用国际霉形体分类分会推荐的生化、遗传学和血清学方法证明其中有两个分离物是两种霉形体混合物,共17株霉形体。所有分离物在无抑菌剂的培养基上连续传代5次未出现细菌形态、对毛地黄皂苷敏感、不水解尿素、DNA的G C含量介于26-34mol％之间。生长抑制试验和间接表面免疫荧光技术的试验结果将其中的15个株分属于霉形体属的5个种,即鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum)4株、滑液霉形体(M.synoviae)2株、衣阿华霉形体(M.iowae)1株、鸡霉形体(M.gallinarum)和雏鸡霉形体(M.pullorum)各4株。其余2株也属霉形体属,但尚未鉴定到种。     

昆明系和Balb／C系小鼠用于显性致死试验的比较研究

本研究选用昆明系和Ｂａｌｂ／Ｃ系小鼠同时进行了显性致死试验的对比试验。试验一选用封闭群昆明系９￣１０周龄的雄性小鼠７８只，随机分成６组，其中５个剂量组分别灌服１６０、５３、１６ｍｇ／ｋｇ体重的复方硝基酚钠和１５、３０ｍｇ／ｋｇ体重的环磷酰胺，另一组为空白对照组。受试物组每天给药一次，连续５ｄ后，按１：２的雄雌性比例与正常的９￣１０周龄封闭群昆明系雌鼠进行交配，每周交配一批，连续交配８批。试验二除选     

肉仔鸡腹腔注射心律平急性毒性试验

21日龄AA 肉仔鸡雌雄各半共110只,分为预试验组,试验组和对照组。按预试验得出的最大有效量、最高致死量和公比确定各试验组剂量腹腔注射心律平,对照组注射生理盐水。结果对照组无死亡,试验组死亡数随剂量加大而增加。试验得出心律平最大有效量为28.56mg/kg,最高致死量为59.22mg/kg,半数致死量(LD50)为41.88mg/kg。中毒鸡表现神经症状和呼吸困难,剖检见肝、肾肿大,心、肺出血等变化。