8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。     

2006—2012年鲁豫冀地区15株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5/Nsp2基因的遗传变异分析

为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后分离到15株PRRSV。分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,与GenBank中68个ORF5序列和40个Nsp2序列的推导氨基酸序列进行比对,遗传变异分析结果表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株Nsp2基因推导的氨基酸序列均存在氨基酸的不连续缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列与JXA1株有较高的同源性(95.5%~97.5%);SDDY2007株与疫苗株RespPRRS MLV和VR2332株亲缘关系相近,处于同一个亚群中;而HN25-2009分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列有30个氨基酸的特征性缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析结果显示该分离株处于VR2332所在亚群(氨基酸同源性97.5%),具有一定特殊性。本试验结果表明,2006—2012年高致病性PRRSV是鲁豫冀地区的优势流行毒株,且存在疫苗毒株,3省区流行毒株间有一定遗传差异,但无明显地域特征。     

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株的分子流行病学调查及防控策略

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2015年1-8月份采自广西省各规模猪场的疑似样品进行PRRSV检测,并对阳性病料进行基因测序分析。结果显示:84份疑似样品中有40份检测为阳性,阳性率为47.6%,通过完整的ORF5基因序列遗传进化分析表明,广西地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且均与高致病性PRRSV高度同源。广西省各规模猪场毒株与2015年7月份采自广东肇庆某规模猪场的PRRSV分离毒株间的同源性均较低,经序列对比发现,广东肇庆分离毒株与美洲流行毒株NADC 30高度同源。结果表明,广西地区主要流行毒株为美洲型高致病性PRRSV毒株,且与美洲流行毒株NADC30同源性较低,但广东地区已出现美洲流行毒株NADC30,提示广西地区需加强对PRRSV流行及变异的监测,以及采取有效防控策略的必要性。     

华中地区猪繁殖与呼吸综合征病毒临床流行毒株Nsp2和GP5氨基酸的遗传变异分析

为了解当前猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2013-2014年间来源于中国华中地区湖北、河南和湖南3省20个猪场65份疑似PRRSV感染的临床样品开展病毒分离工作,通过RT-PCR及间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示成功分离到4株PRRSV。通过测序获得它们的部分Nsp2氨基酸序列,经比对分析,确定分离毒株皆为变异毒株,并且与JXA1、TJ等高致病性毒株有相同的遗传特点,在Nsp2区域有30个氨基酸的不连续缺失。本研究将从临床样品中测序获得的23株PRRSV的GP5氨基酸序列与GenBank公布的有代表性的毒株序列进行遗传进化分析,结果显示所有毒株均为美洲型毒株,其中21株与高致病性变异毒株(JXA1、TJ和HUN4)同源性较高,同时在主要中和位点和N-糖基化位点存在部分氨基酸突变,另外两株与疫苗毒株RespPRRS MLV同源性较高。本试验结果表明,当前高致病性PRRSV依然是优势毒株,其GP5氨基酸突变频繁,不同地区流行毒株存在一定的遗传差异。     

2016年-2017年广东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为研究广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遗传演化情况,采用RT-PCR方法对2016年-2017年采自广东省地区猪场疑似PRRS猪肺脏组织样品中的PRRSV ORF5基因进行了扩增,并对这些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析.结果表明,成功扩增出12株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段.遗传演化分析表明,扩增出的毒株有10株与国内高致病性毒株亲缘关系较近,属于同一分支;2株与广东地区新报道的毒株QYYZ和GM2亲缘关系较近,属于同一分支.氨基酸序列比对结果表明,新分离的毒株在GP5抗原表位上存在广泛的变异.结果表明,该地区PRRSV毒株已经发生广泛变异.研究结果不仅揭示了广东地区流行的PRRSV ORF5基因的遗传演化特性,也为该地区PRRS的防控提供了科学依据.     

华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

为了解2014年和2015年华东部分地区(山东省和福建省)猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的变异情况,试验收集来自华东部分地区猪场的疑似猪繁殖与呼吸综合征样品41份(山东省19份,福建省22份),采用RT-PCR方法分别进行PRRSV、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)检测。对检测出的阳性样品进行PRRSV的分离鉴定和ORF5基因测序,对测得序列进行遗传进化分析和推导氨基酸序列变异分析。结果表明:山东地区PRRSV检出率为74%,其中HP-PRRSV检出率为21%;福建地区PRRSV检出率为56%,其中HP-PRRSV检出率为42%。用Marc-145细胞从疑似猪繁殖与呼吸综合征病料中分离到16株PRRSV,其中10株为福建毒株,6株为山东毒株;测序获得的16株分离株中12株分布于美洲型的4个亚群,4株处于亚群之间的特殊进化位置。16株分离株以点突变为主,未见插入突变,糖基化位点30,44,51 aa处保守,32～35 aa处变异频繁。说明山东和福建地区流行的毒株不断变异,NADC30亚群毒株已经在山东地区出现,福建地区流行毒株仍以高致病毒株为主,但个别毒株已位于特殊进化位置。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

2016—2018年广西猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查和PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行和变异情况,试验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法对2016—2018年广西14个地区规模化猪场的1 564份主要脏器进行了PRRSV检测,选取部分阳性样品进行ORF5基因的扩增并进行序列分析。结果表明:共检测出PRRSV阳性样品467份,阳性率为29.9%。在广西14个地区规模化猪场送检的样品中均能检测到PRRSV。从年份上看,2016年的PRRSV阳性率最高,为43.9%;2017年为26.9%;2018年最低,为23.7%。获得的25条PRRSV ORF5基因序列中有1株与NADC30株同源性较高,1株与GM2株同源性较高,其余23株均与高致病性PRRSV同源性较高。在25株PRRSV中有21株与TJM、JXA1、HuN等高致病毒株亲缘关系较近,并位于同1个分支;2株处于经典株和变异株之间,分别形成2个分支;1株与NADC30株亲缘关系较近,位于同1个分支;1株与GM2株亲缘关系较近,位于同1个分支。PRRSV ORF5基因编码氨基酸序列分析结果表明,25个毒株均为毒力较强的野毒株。说明广西地区仍以高致病性PRRSV为主要流行毒株,但2018年新发现类NADC30毒株和类GM2毒株的流行。     

华东地区部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒检测及其ORF5遗传变异分析

为了实时掌握猪场PRRSV的感染情况,对其遗传变异趋势进行跟踪分析,本文利用RT-PCR方法对2011—2013年采自苏北地区和上海浦东地区部分猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪的血清进行PRRSV检测,并对ORF5基因进行扩增测序,分析PRRSV ORF5的遗传变异情况。试验共采集样本328份,其中苏北某猪场258份,检测阳性样本为113份,浦东地区70份,阳性样本17份。每次检测选择一个样品进行ORF5测序分析。结果表明,本文所获得的15株分离株的ORF5序列与美洲型毒株氨基酸同源性为80.2%⁹9%,与欧洲型毒株同源性为53.4%99%,与欧洲型毒株同源性为53.4%⁶0.1%,均属于美洲型。进化树分析表明,有12个ORF5序列与高致病性PRRSV参考毒株同缘关系较近,其中包括苏北某猪场10份及浦东某猪场2份。结果显示,两猪场均存在PRRSV感染情况,且高致病性PRRSV与经典PRRSV并存,病毒ORF5中和表位都有变异发生,PRRSV的分布没有呈现明显的地域性差异。本试验为进一步研究华东地区猪场PRRSV感染情况及分子流行病学特征积累了有益资料。     

华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

为了解华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株变异情况,本研究以RT-PCR技术对山东、福建发病猪场的41份组织样品进行PRRSV检测和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)相关毒株(HP-PRRSVLike)检测,对阳性样品进行PRRSV分离、ORF5基因测序及变异分析。结果显示,福建、山东样品的阳性率分别为56%、74%;共分离到16个美洲型毒株(福建10株、山东6株),分属于Lineage 8、Lineage 5、Lineage 3、Lineage 1四个谱系,其中以Lineage 8为主。这表明PRRSV流行毒株多样化,跨谱系毒株重组值得警惕。     

PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析

从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将该毒株命名为YN-LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征,根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物,对YN-LQ株全基因进行扩增及测序,将测序结果依次拼接获得YN-LQ株的全基因序列,并进行序列的比对分析。结果显示:PRRSV YN-LQ株基因组全长为15 320bp;将YN-LQ株与经典PRRSV病毒株Nsp2、GP5及全基因进行比对分析,发现YN-LQ株与JXA1的同源性最高。Nsp2基因序列同源性为99.0%,其氨基酸序列有15个位点发生了改变;GP5基因序列同源性为97.7%,其氨基酸序列有9个位点发生了改变;全基因的同源性为98.7%。证实该毒株为JXA1变异株,为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

一株重组类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组分析

为分离上海地区猪繁殖与呼吸综征病毒（PRRSV）并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染病猪的2份肺样进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将盲传3代后出现细胞病变的PAMs经间接免疫荧光鉴定,通过RT-PCR扩增分离株全基因组序列,测序后与GenBank登录的参考株全基因组序列进行同源性及遗传进化分析,分析了分离株Nsp2、GP5氨基酸序列的遗传进化关系,并对分离株做了重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,成功分离出1株PRRSV,命名为SH2019,其全基因组开放阅读框大小为14677 bp,分离株与NADC30的核苷酸同源性最高,属于目前流行于中国的类NADC30 PRRSV,其Nsp2存在131个氨基酸缺失的分子特征;分离株是以谱系1毒株为主要亲本,以谱系3、谱系5或谱系8毒株为次要亲本,在12601~12901 nt(ORF2~ORF4)发生了基因重组的重组毒株,分离株不能感染Marc-145细胞。本研究分离鉴定一株重组类NADC30 PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防控提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序.应用DNAStar 7.0、ClustaⅨ 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%.因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp2基因并测序。应用DNAStar 7.0、ClustalX 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%。因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近。     

2016-2017年我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株分子遗传演化分析

为了解我国华北地区类NADC30流行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及遗传变异情况,本研究自2016~2017年采集华北四省市(北京、天津、山东及河北)部分猪场疑似PRRSV样品239份进行RT-PCR检测,对所有阳性样品的ORF5基因测序分析及部分阳性样品病毒分离,并选择1株基因缺失病毒TJjh1602株进行全基因的序列扩增及分析.结果显示:PRRSV检测总阳性率44.35%(106/239),遗传进化显示52.83%(56/106)的流行毒株与类NADC30相近且位于系谱1(lineage 1),其中32.14%(18/56)的类NADC30流行毒株具有相同特征性的氨基酸位点缺失;TJjh1602株全基因长度为15018 nt,与NADC30同源性为95.2%,除具有上述特征性氨基酸位点缺失外,无其他插入或缺失.研究结果推测PRRSV类NADC30毒株在我国华北地区广泛流行,同时已遗传演化成一类具有ORF5缺失分子标签的新型类NADC30毒株,提示需进一步加强对PRRSV新型缺失毒株的流行病学调查及相关致病力研究.     

河北省PRRSV流行毒株的分离鉴定

为了全面调查猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在河北省的流行情况,本研究共收集河北省833份病死猪临床样品,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测,共检出419份阳性病料,阳性率高达50.3%。其中NADC30-like PRRSV阳性率为49.1%;HP-PRRSV阳性率为3.1%;经典株PRRSV没有检出;HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV共感染样品为16份,共感染率为1.9%。此外,本研究成功地分离到3株NADC30-like毒株,并测通其全基因组序列,与国内外流行毒株进行序列比对和基因重组分析发现,这3个毒株中的QHD1株为重组毒株,亲本可能为PRRSV NADC30毒株和疫苗株RespPRRS MLV,2处重组分别位于7 913～8 015nt和12 780～13 158nt处。本研究为河北省PRRSV的深入研究和防控奠定了基础。     

甘肃省猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析

为了解甘肃省地方猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的感染情况，对2015-2020年采集的20个猪场332份疑似PRRSV感染猪的样品，首先进行血清学检测，然后通过RT-PCR方法开展病原检测，扩增PRRSV的ORF5基因；测序后利用DNA Star软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系。血清学检测结果阳性率为93.07%,扩增获得的PRRSV ORF5基因，经核苷酸序列比对属于PRRSV美洲型，有NADC30-like毒株和NADC34 like毒株。结果表明，当前PRRSV不同流行毒株存在一定的遗传差异，为甘肃省PRRS防控提供了科学依据。     

2014-2017年山东省部分规模化猪场PRRSV ORF5基因的遗传演化分析

为了解山东省规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行情况及其分子特征,对2014-2017年其省内96个规模化养殖场的236份疑似PRRSV感染猪的肺脏、淋巴结、脾脏等病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品进行ORF5基因的克隆测序和遗传演化分析。共检测到阳性样品122份,阳性率51. 7%,测序获得122条ORF5基因序列。所检测PRRSV ORF5核苷酸序列同源性与氨基酸同源性分别是:78. 9%～99. 7%和73. 7%～99. 5%。遗传演化分析结果表明,山东地区主要存在4个Lineage的PRRSV毒株,以Lineage 1(NADC30-like)、Lineage 5(VR-2332)和Lineage 8(Hu N4)的毒株为主要流行株,其中Lineage 1检出率最高(46. 7%)。本研究在2014年检测到的Lineage 1毒株是国内首次报道,可能由美国引入,尚未在我国广泛流行。氨基酸比对分析表明,ORF5基因存在较大变异,但各Lineage毒株在ORF5基因的进化上具有保守性,均具有独特的氨基酸特性。通过对PRRSV ORF5遗传演化分析,表明山东地区PRRS的流行具有广泛的毒株变异特性,毒株的持续变异,增大了PRRS临床防控的难度,同时该研究为PRRS的防控提供一定的数据支持。     

一株猪高致病性蓝耳病病毒的分离鉴定与遗传变异分析

为研究猪蓝耳病病毒(PRRSV)的遗传进化规律,于2018年从新疆某猪场采集的病猪血液中分离了一株PRRSV,命名为XJ-b。对临床样品采用RT-PCR扩增鉴定,将阳性样品过滤处理之后接种在Marc-145细胞系进行培养,将盲传3代之后出现病变(CPE)的Marc-145样品进行间接免疫荧光鉴定。通过噬斑纯化后,利用RT-PCR对分离株的全基因组进行扩增,使用SeqMan软件对测序结果进行拼接,并根据NCBI上已公布的PRRSV全基因组及Nsp2基因核苷酸序列进行遗传进化与同源性比对分析。结果表明,临床病料RT-PCR检测呈PRRSV核酸阳性,处理后的病料接种至Marc-145细胞72 h之后产生CPE,间接免疫荧光鉴定为PRRSV抗原阳性;序列拼接显示分离株全基因组开放阅读框大小为15119 bp;全基因组和Nsp2基因核苷酸序列分析和同源性比对显示该分离毒株属于中国的高致病性PRRSV亚群。研究结果可为近年来新疆地区PRRSV的毒株差异分析提供参考。