昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

紫花苜蓿耐盐相关基因克隆研究进展

随着植物分子生物学的快速发展,对植物耐盐性的研究已深入到耐盐相关基因的克隆、基因结构与功能的分析及其表达特性的研究。紫花苜蓿(Medicago sativa)是比较耐盐的植物,从苜蓿中分离克隆耐盐相关的基因,分析其结构与功能。不仅可以加深对耐盐分子机制的认识,而且在植物基因工程领域具有重要的应用前景。本文综述了苜蓿盐诱导相关基因的研究进展。     

紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化

NAP转录因子是植物体内特有的转录因子,在调控植物生长发育、衰老速度以及响应生物、非生物胁迫等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆紫花苜蓿NAP转录因子基因,将其命名为MsNAP(GenBank登录号:KM211498.1),MsNAP编码区长822bp,编码274个氨基酸。生物信息学分析显示:其与其他物种NAP蛋白具有较高的同源性,与蒺藜苜蓿同源性最高。荧光定量技术分析结果显示:MsNAP基因在花中表达量最高,衰老叶片中的表达水平远远高于未衰老叶片。利用DNA重组技术将MsNAP基因完整编码区连接至植物表达载体pBI121,成功构建植物表达载体pBI-MsNAP,通过农杆菌介导方法转化烟草,PCR和RT-PCR检测结果显示,成功获得了转MsNAP基因的转基因烟草,初步证明在转基因烟草中外源基因MsNAP能够转录表达,为研究MsNAP基因功能奠定了基础。     

鸡β2-微球蛋白的基因克隆与原核表达

本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m 基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp,编码120个氨基酸,与基因库公布的相一致,同源性为100%;经0.8 mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清;利用His标签纯化该蛋白, SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带;Western-blot分析表明,纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实,本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白,为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。     

紫花苜蓿MsHST基因克隆及拟南芥转化

运用RT-PCR法从紫花苜蓿（Medicago sativa）中成功克隆出长度约1100 bp的尿黑酸法呢基转移酶基因MsHST,采用qRT-PCR的方法,分析MsHST基因的表达特征,结果显示MsHST在所有组织中均有表达,但在叶片中表达量最高,根中最低;随叶片的衰老,表达量降低。且构建了超表达载体pBI-MsHST,并获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）转基因植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测转基因植株,初步证实目的基因在拟南芥中表达。     

山羊FTO基因克隆及其表达谱

本研究旨在阐明山羊FTO基因的表达特性,并分析其表达与肌内脂肪沉积的相关性。以简州大耳羊为试验动物,采用RT-PCR方法克隆FTO基因,利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测其组织表达差异,同时检测该基因在不同发育阶段不同部位山羊肌肉组织中的表达水平,并与IMF含量进行相关分析。结果表明,山羊FTO基因CDS区为1 518bp,编码505个氨基酸,为无跨膜结构的非分泌蛋白。FTO mRNA在山羊的脂肪、脾和肺中表达水平较高(P0.01),在背最长肌中表达最低;FTO蛋白在背最长肌和脾中表达较高(P0.01),脂肪组织中表达次之。同时结果显示,FTO mRNA在24月龄山羊背最长肌和股二头肌中表达水平显著高于1~3和8~10月龄的表达水平(P0.05)。FTO mRNA表达量与背最长肌IMF含量呈显著负相关(P0.05),与股二头肌及臂三头肌IMF含量呈不同程度的正相关。本研究指出,FTO基因表达与IMF含量存在相关性,推测可作为IMF沉积的候选基因。     

猪圆环病毒2型ORF2基因克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

猪圆环病毒2型（Porcine　circovirus　type　2，PCV2）是仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PWMS）的病原。它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。目前，PCV2己经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。     

新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建

为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。     

鸡IFN-γ基因克隆表达及其抗球虫研究进展

鸡干扰素主要由活化的T细胞、NK细胞产生,具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。鸡干扰素-γ基因已经被成功克隆并在Vero细胞和大肠杆菌等表达系统中表达,并且被证明与鸡球虫病的免疫有关,它可激活巨噬细胞,增强K细胞、NK细胞的抗感染作用。另外,ChIFN-γ可用作免疫增强剂,具有广泛的应用前景。     

兔防御素NP2基因克隆及其毕赤酵母表达的研究

根据兔防御素NP2基因序列和Pichia酵母密码偏爱性，设计兔防御素NP2基因序列片段，构建pGAPZαA酵母表达重组子，转化E．coli JM109，扩增重组子，经限制性内切酶BlnI线性化，转Pichia酵母。PCR扩增挑选阳性转化子，SDS-PAGE电泳分析兔防御素NP2酵母表达、Bradford法蛋白质定量和抗菌试验。结果表明：兔防御素NP2可在Pichia酵母中表达，且对大肠杆菌具有显著的抗菌作用，为兔防御素NP2深入研究和开发利用奠定了一定的物质和理论基础。     

沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的克隆鉴定与表达谱分析

为明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica热激蛋白70 (Heat shock protein 70,Hsp70)基因的序列结构及其系统进化关系,本研究通过PCR技术克隆沙葱萤叶甲Hsp70基因cDNA全长序列与基因组序列,并进行生物信息学与表达谱分析。结果显示,克隆获得了沙葱萤叶甲2条Hsp70基因GdHsp70-2(GenBank登录号：MZ853083)和GdHsp70-3(Genbank登录号：OK585088),基因全长分别为2 410 bp和2 242 bp,各自编码657和646个氨基酸,均含有3个保守的HSP70家族特征序列,预测蛋白三维结构均由N-端ATPase功能域和C-端底物结合功能域所组成;系统发育分析表明GdHSP70-2,GdHSP70-3分别与松墨天牛(Monochamus alternatus)MaltHSC70-1、玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera) DvirHSP70-2的亲缘关系最近;基因组DNA克隆获得GdHsp70-2的两段内含子序列,GdHsp70-3则不含有内含子;表达谱分析结果表明GdHsp...     

托佩克猪SLA-2基因克隆与表达

为提高托佩克猪SLA-2-TPK基因胞外区在pET-21a的表达量,对其5′端进行密码子优化,并设计表达引物,PCR扩增SLA-2-TPK胞外区,然后克隆入pMD○R19-T Simple Vector,经酶切鉴定后连接至pET-21a载体,转化BL21(Rosseta)进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。PCR结果显示,SLA-2-TPKe大小约为850bp,并成功克隆入pMD○R19-T Simple Vector,双酶切后大小为834bp。酶切后的SLA-2-TPKe成功与pET-21a链接,重组菌经诱导后目的蛋白大小为30.9ku,与密码子优化前重组菌相比,目的蛋白相对表达含量提高约40%。研究证明,密码子优化可明显提高蛋白的表达量,为进行其他蛋白表达研究提供了参考。     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1(Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase1,ROCK1)的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065bp的开放阅读框(ORF),编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪(P0.01),出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异(P0.05)。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1（Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1）的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065 bp的开放阅读框（ORF）,编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪（P < 0.01）,出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异（P > 0.05）。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

紫花苜蓿MsUGT87A1基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

尿苷二磷酸(Uridine diphosphate, UDP)糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase, UGT)催化植物体内黄酮等次生代谢产物的糖基化反应,在植物抵御逆境胁迫过程中具有重要作用。本研究从紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆UGT家族基因MsUGT87A1,利用生物信息学方法对其蛋白质理化性质、二级结构和亚细胞定位等进行分析,并通过荧光定量PCR分析MsUGT87A1基因的组织表达特异性及对不同非生物胁迫的响应情况。结果表明,MsUGT87A1基因全长1 353 bp,编码450个氨基酸,蛋白质相对分子量为50.98 kDa,理论等电点(pI)为5.78,属于亲水性蛋白,主要定位于细胞质中。系统进化树结果表明紫花苜蓿MsUGT87A1与蒺藜苜蓿、红三叶等豆科植物的UGT87A1同源性较高。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中表达量最高,对干旱、盐和ABA处理均有响应,初步确定MsUGT87A1基因参与紫花苜蓿应对干旱及盐胁迫响应。该研究为进一步探究MsUGT87A1基因功能奠定基础,为紫花苜蓿抗逆性遗传改良提供理论依据。     

紫花苜蓿MsMYB58基因克隆及抗旱功能鉴定

干旱是限制紫花苜蓿(Medicago sativa)生长的重要环境限制因子,MYB转录因子广泛参与调控植物的生长发育和非生物胁迫。本研究对紫花苜蓿MsMYB58基因进行克隆及生物信息学分析,初步解析紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能。结果显示,MsMYB58开放阅读框全长1 002 bp,编码蛋白含有333个氨基酸,分子量为37.80 kDa,属于典型的R2R3-MYB家族成员,定位在细胞核、细胞壁和细胞膜中。MsMYB58的组织特异性表达主要在茎中,在根中的表达最少;在脱落酸、盐和自然干旱处理中,MsMYB58的表达水平呈现不同的变化趋势。干旱胁迫下,过表达MsMYB58的转基因烟草的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性和脯氨酸含量显著增加,而丙二醛的含量则显著下降,叶绿素荧光参数PSⅡ利用效率和PSⅡ最大光化学量子产量显著升高,非光化学猝灭显著下降。本研究初步探究了紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能,为进一步挖掘紫花苜蓿干旱响应功能基因提供理论基础。     

鹅ApoER2基因克隆及其在卵泡发育过程中的表达模式研究

为研究载脂蛋白E受体2(ApoER2)在鹅卵泡发育过程中的表达模式,本研究克隆了鹅ApoER2基因cDNA部分序列,并用Real-time PCR方法检测其在鹅等级前和等级卵泡颗粒层和膜层中的mRNA表达水平。结果表明:克隆得到的鹅ApoER2 cDNA部分序列长848 bp,编码282个氨基酸,预测的鹅ApoER2部分氨基酸序列有4个低密度脂蛋白受体家族的保守结构域,包括低密度脂蛋白受体重复A类结构域、重复B类结构域、YWTD结构域和钙结合表皮生长因子样结构域;ApoER2在卵泡颗粒层和膜层的表达水平均在F1卵泡处显著性升至最高(P0.05),在其他等级和等级前卵泡颗粒层均趋于平稳(P0.05),且在等级卵泡中的表达均高于等级前卵泡,在卵泡膜层中的表达先降低后显著性升高(P0.05)。总体来看,ApoER2在鹅不同等级卵泡颗粒层的表达水平均远高于膜层。以上结果说明,鹅ApoER2蛋白应该具有转运脂质的功能。相比卵泡膜层,ApoER2主要在颗粒层实现其功能,重点表现在等级卵泡上,这可能与鹅卵黄脂质沉积特点有关。     

草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2（Acot2）的基因功能,并对其进行生物信息学分析,检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列（登录号：NM_001101938.1）设计引物,PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序,利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树;获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点,预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型;利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示,草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp,编码464个氨基酸,其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高（98.3%）,与猕猴和黑猩猩的同源性较低（80.5%和80.4%）。Acot2蛋白分子式为C₂₃₁₇H₃₆₀₆N₆₄₀O₆₂₈S₁₄,分子质量为50.924 ku,理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50,氨基酸残基多数为亲水性残基,总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明,Acot2蛋白分布在内质网（30.4%）、线粒体（26.1%）、高尔基体（17.4%）、细胞质（17.4%）、液泡（4.3%）和细胞质（4.3%）中;磷酸化位点分析发现,Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋（21.8%）、β-转角（33.4%）、β-折叠（18.4%）和无规则卷曲（26.4%）,三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示,Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高,在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性,其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定,属于水溶性蛋白,在线粒体和内质网中发挥作用,在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。     

草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2(Acot2)的基因功能,并对其进行生物信息学分析,检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列(登录号:NM_001101938.1)设计引物,PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序,利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树;获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点,预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型;利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示,草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp,编码464个氨基酸,其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高(98.3%),与猕猴和黑猩猩的同源性较低(80.5%和80.4%)。Acot2蛋白分子式为C_(2317)H_(3606)N_(640)O_(628)S_(14),分子质量为50.924 ku,理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50,氨基酸残基多数为亲水性残基,总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明,Acot2蛋白分布在内质网(30.4%)、线粒体(26.1%)、高尔基体(17.4%)、细胞质(17.4%)、液泡(4.3%)和细胞质(4.3%)中;磷酸化位点分析发现,Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋(21.8%)、β-转角(33.4%)、β-折叠(18.4%)和无规则卷曲(26.4%),三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示,Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高,在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性,其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定,属于水溶性蛋白,在线粒体和内质网中发挥作用,在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。     

兔NLRC3基因克隆及其表达特性研究

本研究旨在探究兔NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptor family CARD domain containing 3,NLRC3）基因序列、分子结构和体内外表达特性。根据GenBank中公布的预测序列（登录号：XM_017338739.1）设计引物,PCR扩增并克隆兔NLRC3基因,利用生物信息学方法对其分子结构进行预测分析。构建真核表达载体pcDNA3.1-rNLRC3-HA,通过间接免疫荧光试验探究兔NLRC3的亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR检测NLRC3基因在兔各组织中的分布情况及肠出血性大肠杆菌感染后表达水平的变化。结果表明,兔NLRC3基因编码区长3 192 bp,相似性比对及系统进化树显示,兔NLRC3与其他哺乳动物相似性较高,并在进化树中处于同一分支。兔NLRC3由N-端、NACHT及LRR结构域组成,三级结构模型呈单曲率马蹄形,凸面由α-螺旋组成,凹面由β-折叠组成。间接免疫荧光试验结果显示,兔NLRC3位于细胞浆中,且不与线粒体共定位。兔NLRC3基因在所有被检组织中均有表达,且在脾脏中的表达量最高,其次是肠系膜淋巴结、淋巴滤泡。肠出血性大肠杆菌感染机体后,在脾脏、肝脏、肾脏中兔NLRC3基因mRNA表达量均上调,表明兔NLRC3基因参与了肠出血性大肠杆菌感染后的免疫应答。综上,本研究成功克隆了兔NLRC3基因并进行了生物信息学分析,明确其为胞内受体,在各组织中广泛分布,并参与了细菌感染后的免疫应答,为进一步探究兔NLRC3在炎症反应中的调控机制提供了基础材料。