miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

颗粒细胞是卵巢中必需的体细胞,在卵泡发育过程中起重要作用。为探究miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响,本实验中2个处理组分别转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和miRNA模拟物(mimics NC),转染48h后,通过Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测内源miR-10b表达量,明确miR-10b mimics转染成功。利用qRT-PCR和Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量的变化;利用流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示:与mimics NC组相比,miR-10b mimics组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高;同时miR-10b mimics组的细胞凋亡率较mimics NC组显著升高。结果表明,miR-10b可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。     

miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响

旨在探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响及作用机制.本研究选取健康的3～4月龄大足黑山羊母羊,收集卵巢颗粒细胞,利用miR-495-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)构建过表达和抑制模型,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期,ELISA分析颗粒细胞的雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌,采...     

miR-15a对猪卵泡颗粒细胞BDNF基因表达的影响

为探索miR-15a对猪卵泡发育的影响,选取健康大卵泡、中等卵泡和闭锁卵泡,研究不同卵泡中miR-15a的相对表达量以及其是否对卵巢颗粒细胞中有BDNF表达具有调节作用。分别抽取直径3-5 mm、大于5 mm健康卵泡和3-5 mm闭锁猪卵泡,采用q PCR检测发现闭锁卵泡中miR-15a表达显著升高。免疫组化结果显示中等健康卵泡颗粒细胞上BDNF、Tr KB均有表达,而在靠近卵泡腔的凋亡颗粒细胞BDNF免疫阳性反应较弱。分离培养猪卵巢颗粒细胞,过表达miR-15a能显著上调BDNF基因表达水平,Bcl-2基因表达有下降趋势但差异不显著;抑制miR-15a表达能显著抑制BDNF、bcl-2基因表达水平。Western-Blot结果发现,过表达miR-15a显著下调BDNF蛋白水平,而抑制miR-15a表达则能显著上调BDNF蛋白水平。实验结果显示miR-15a可能经由其靶基因BDNF参与猪卵泡的发育和闭锁。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

INHA基因干扰对马关无角山羊卵巢颗粒细胞的影响

为了揭示INHA基因在马关无角山羊卵泡发育过程中的作用,为山羊多胎性状的研究提供理论依据,以高繁殖力地方品种--马关无角山羊的卵巢颗粒细胞为研究对象,采用siRNA技术,对卵巢颗粒细胞所分泌的糖蛋白激素基因INHA进行了干扰,Western blot法检验了干扰后INHA蛋白的表达量,Real-time PCR法检测了干扰后凋亡家族主要基因、主要生长因子及激素受体的mRNA表达量变化。Western blot结果显示,干扰48h后的INHA蛋白的表达量极显著低于正常组和阴性对照组(negative control,NC)(P0.01);Real-time PCR结果显示,凋亡促进基因Bax在转染后,表达量极显著低于正常组和NC组(P0.01),凋亡抑制基因bcl-2和bcl-xl基因在转染后,表达量极显著高于正常组和NC组(P0.01);主要生长因子IGF-1和IGF-2基因在转染后,mRNA的表达量明显减少(P0.01),其中IGF-1的表达量降低最为明显;激素受体FSHR和LHR基因mRNA的表达量极显著低于正常组和NC组(P0.01)。由此推测,INHA基因可能是通过影响卵巢颗粒细胞凋亡/增殖,进而影响了卵泡的发育。     

山羊卵泡颗粒细胞和输卵管上皮细胞共培养对山羊体外受精胚胎发育的影响

试验共分 3组 :对照组为单独培养液 ;第 2组为单层颗粒细胞 ;第 3组为输卵管上皮细胞 ,将山羊体外受精胚胎随机放入以上 3组处理中。结果显示山羊体外受精胚胎在卵泡颗粒细胞中发育到囊胚的比率为 4 1.0 % ,在输卵管上皮细胞中发育到囊胚的比率为 5 8.1% ,而在M199培养液中为 5 .6 %。山羊体外受精胚胎分别与山羊卵泡颗粒细胞和输卵管上皮细胞共同培养时 ,均可提高山羊体外受精胚胎的发育进程。且输卵管上皮细胞比颗粒细胞能显著提高山羊体外受精胚胎的发育进程 (P <0 .0 5 )。     

醋酸铅对小鼠卵巢组织结构和卵巢颗粒细胞凋亡的影响

将40只20日龄雌性昆明系小鼠随机分成3个处理组和1个对照组,每组10只。给3个处理组小鼠分别连续2d腹腔按体质量注射醋酸铅10,20,40mg/kg,对照组小鼠注射等体积的生理盐水。于注射后24,72h分离卵巢,用原位末端标记法(TUNEL)测定卵巢颗粒细胞的凋亡率,研究卵巢组织结构及卵巢颗粒细胞凋亡的变化。结果显示,醋酸铅可使小鼠卵巢组织结构发生病变,加速卵巢颗粒细胞的凋亡,且凋亡率随着攻毒剂量的增加和时间的延长而升高,与对照组相比,差异极显著(P0.01);表明醋酸铅对小鼠卵巢具有毒性作用,可诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡,并呈现一定的剂量-时间依赖关系。     

miR-1307在猪卵巢颗粒细胞周期中的作用

为了解猪miR-1307序列和结构特征,阐明其在猪卵巢颗粒细胞周期中的作用,利用生物信息学方法分析猪miR-1307的序列特征、染色体定位和潜在的生物学功能;在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中转染miR-1307模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor),利用流式细胞术检测细胞周期。结果显示:猪miR-1307前体序列长度为80 bp,其核苷酸序列(包括成熟序列和种子序列)和基因组定位等与哺乳动物其他物种高度一致;功能富集分析发现miR-1307靶基因富集在rRNA分解代谢进程和蛋白酪氨酸磷酸酶活性等多个重要的生物学进程和分子功能中;在猪卵巢颗粒细胞中,过表达miR-1307可使G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例显著降低(P<0.05);抑制miR-1307可使G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例显著增加(P<0.05)。结果表明:miR-1307是猪卵巢颗粒细胞周期的重要调节因子。     

Wnt10b对山羊前体脂肪细胞分化相关基因表达的影响

旨在利用RNA干扰技术,明确Wnt10b基因对山羊前体脂肪细胞分化的影响。设计合成山羊Wnt10b siRNA序列,利用胶原酶消化法获得山羊皮下和肌内前体脂肪细胞。利用有效的siRNA序列干扰山羊皮下和肌内前体脂肪细胞Wnt10b基因表达后,检测其对细胞分化及脂肪细胞分化标志基因表达的影响。结果表明,筛选获得有效的山羊Wnt10bsiRNA序列,转染山羊皮下和肌内前体脂肪细胞后,Wnt10b被显著干扰,其mRNA表达量分别下调63%(P0.01)和67%(P0.01);油红O染色结果显示,干扰Wnt10b基因可明显抑制山羊皮下和肌内脂肪细胞的脂滴积聚;且干扰Wnt10b基因后,在皮下前体脂肪细胞分化过程中C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和Pref1基因出现极显著下调(P0.01),LPL出现显著下调(P0.05);而在肌内前体脂肪细胞分化过程中,AP2和LPL基因出现极显著下调(P0.01),C/EBPβ出现显著下调(P0.05),Pref1出现极显著上调(P0.01)。本试验发现,Wnt10b基因可能通过调控C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和LPL的表达来促进山羊皮下前体脂肪细胞分化,通过调控AP2、LPL、C/EBPβ和Pref1的表达来促进山羊肌内前体脂肪细胞分化。     

姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养的影响

本试验研究了添加姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中增殖、凋亡自噬及间隙连接等生物学过程的影响。设置不同浓度(1,5,10,25,50,100μg/m L)的姜黄素,对颗粒细胞的凋亡、增殖、自噬和间隙连接等基因与蛋白的表达进行定性与定量检测,发现高浓度姜黄素会导致细胞凋亡标记Caspase-3及自噬基因Beclin-1的基因表达量上升,间隙连接蛋白Cx43基因表达量下降,细胞增殖标记PCNA表达量无显著变化。研究结果为姜黄素在调节卵巢颗粒细胞功能提供了一定的理论依据。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

颗粒细胞对卵泡发育的影响

卵泡发育是一个复杂的生理过程,通过间隙连接,颗粒细胞在卵母细胞的生长发育过程中起营养作用,并促进卵母细胞的成熟;颗粒细胞和膜细胞的相互作用是卵泡发育和维持正常功能的重要条件。作为卵泡发育的标志,颗粒细胞的生长分化是原始卵泡启动和生长的关键,并通过受体介导途径调控生长期卵泡的发育及卵泡闭锁,从而在卵泡发育过程中起重要的调控作用。     

牛卵泡颗粒细胞中生长相关基因的表达研究

随着卵巢卵泡的生长,卵泡内雌激素分泌量逐渐上升,雌激素通过其受体(Estrogen Receptors,Esrs)对卵泡的调节作用也在发生改变。该研究通过手术法获取牛卵巢上不同直径的卵泡颗粒细胞,对颗粒细胞中雌激素受体及相关基因表达进行研究。结果表明:Esr1和Esr2都能在牛卵泡颗粒细胞中表达,且随着卵泡的生长而显著下降(P0.05);Fshr的表达随着卵泡的生长而显著上升(P0.05),但在中、大型卵泡颗粒细胞中差异不显著(P0.05);Lhr在大型卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于小、中型卵泡(P0.01);随着卵泡的生长,Cox2在颗粒细胞中的表达显著上升(P0.05),而Hsd17b1的表达则显著下降(P0.05)。综上所述,随着卵泡生长,卵泡颗粒细胞对Esr1、Esr2作用的依赖性逐渐减弱;大卵泡在排卵前Lhr表达量急剧上升,同时诱导Cox2表达量显著上升而Hsd17b1表达量显著下降,表明大卵泡已启动排卵反应。     

水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定

研究主要是通过比较水牛卵巢颗粒细胞在不同培养基中的生长状态,并对细胞的增殖、核型及凋亡情况进行检测,以了解水牛卵巢颗粒细胞体外生长特性,建立水牛卵巢颗粒细胞的体外培养体系。结果发现,分离获得的水牛卵巢颗粒细胞存活率约为60%;采用DMEM培养基,颗粒细胞的生长速度和生长状态优于TCM-199和DMEM/F12培养基;细胞培养24 h后开始零星增殖,3~5 d增殖速度达到高峰;第1、3、5、7代颗粒细胞正常核型比率差异不显著,均在85%以上;第1代颗粒细胞的凋亡率与第5代差异显著(P<0.05),与第7代差异极显著(P<0.01)。结果表明,DMEM培养基更适宜用于水牛颗粒细胞的体外培养;水牛颗粒细胞能稳定地进行传代培养,染色体的数目不会发生明显改变,但细胞凋亡率会随着培养代数的增加而明显升高。     

神经生长因子对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响

本研究旨在探索神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。试验建立了小鼠卵巢颗粒细胞的原代培养体系,并通过免疫荧光技术对颗粒细胞进行鉴定和检测NGF及其受体在卵巢颗粒细胞上的表达,采用MTS法检测不同浓度的NGF对昆明小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。卵巢颗粒细胞在10、50、100、500 ng/mL NGF作用24 h,用酶标仪测定细胞D_{490 nm}值,试验组与对照组相比均有促进增殖的影响（P<0.05）,50 ng/mL NGF试验组与对照组相比差异极显著（P<0.01）。结果表明,NGF在昆明小鼠的卵巢颗粒细胞中有表达,在一定浓度范围NGF可以促进卵巢颗粒细胞的增殖。     

p38MAPK抑制剂SB202190对猪颗粒细胞活力的影响

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated potein kinase,MAPK)家族成员,是细胞内重要的信号转导系统之一,对细胞的生长、分化、凋亡具有重要影响及作用。为探究p38MAPK信号对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及其可能作用机制,研究以体外培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,在培养液中分别添加浓度为0、1、10、20μmol/L的p38MAPK特异性抑制剂SB202190。以免疫细胞化学染色法鉴定体外培养猪卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测其增殖活性,应用Annwxin V-FITC/PI及细胞周期试剂盒染色检测细胞凋亡及细胞周期状况,以实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞中凋亡、周期相关基因的相对表达水平。结果表明,添加p38APK信号抑制剂SB202190可抑制体外培养猪卵巢颗粒细胞的增殖活性,20μmol/L处理组与其他组相比呈显著性差异(P0.05);20μmol/L SB202190添加处理未显著影响颗粒细胞的凋亡水平,而该浓度SB202190可将大部分细胞阻滞在G1/G0期,与对照组相比差异显著(P0.05);基因相对表达水平检测显示SB202190添加可抑制Fas、FasL、CDK-4的表达,而同时促进Bcl-2、Bax、P27的表达(P0.05),对Caspase-3的表达没显著影响(P0.05)。综上所述,SB202190通过调控猪卵巢颗粒细胞的周期来影响其增殖作用,但对其凋亡没有影响。     

鹌鹑卵泡发育过程中颗粒细胞黄体生成素受体mRNA的表达

用Ｎorthern杂交的方法研究了鹌鹑排卵泡内颗粒细胞黄体生成素受体（ＬＨＲ）mＲＮＡ的表达。在预计排卵前２０h和３h分别取出最大的３个卵泡（Ｆ１、Ｆ３卵泡）以及小黄卵泡（ＳＹＦ）,剥离颗粒层提取出总ＲＮＡ,并经变性凝胶电泳后将ＲＮＡ转移到滤膜上。杂交所用的探针是用特异的引物经反转录一多聚栈链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出编码ＬＨＲcＤＮＡ的细胞外区（ＥＣ）和跨膜区（ＴＭ）cＤＮＡ。结果表明,颗粒细胞ＬＨＲmＲ     

The Effect of Caffeic Acid on Zearalenone-induced Ovarian Granulosa Cell Apoptosis in Mice

Ovarian granulosa cells provide a special microenvironment for follicle formation and maturation through interaction with oocytes and their own secretion. A variety of harmful stimuli can cause granulosa cell apoptosis and metabolic disorders, reduce the quality of oocytes and have a negative impact on embryo formation. Zearalenone (ZEA) is a common cause of ovarian granulosa cells injury in the livestock industry, which is produced by mycotoxins, and lack of effective treatment drug. Therefore, in the current study zearalenone was used to induce ovarian granulosa cell injury and to explore the protective effect of caffeic acid on zearalenone-induced ovarian granulosa cell apoptosis in mice. Mouse ovarian granulosa cells were isolated by mechanical method, and indirect immunofluorescence was used to identify the isolated cells. MTT assay was used to determine the effect of caffeic acid on the activity of normal mouse ovarian granulosa cells.After granulosa cells were co-treated with caffeic acid (200, 100 and 50 μg·mL^-1) and ZEA for 24 hours, and control and ZEA group were set up at the same time, cell morphology and adherence were observed under a microscope. MTT was also used to detect cell viability. Caspase-3 mRNA expression level was detected by qRT-PCR. Cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP protein expre-ssion levels were determined by Western blot. The results showed that positive FSHR staining appeared in cell cytoplasm of the test group, which confirmed that the isolated cells were mouse ovarian granulosa cells. The cell viability was above 90% which showed that caffeic acid had no toxic effect on granulosa cells. Compared with control group, ZEA group had smaller cell size, poor adherence, increased cell gap, and significant reduction in cell viability (P<0.001). Furthermore, the relative expression of caspase-3 mRNA, and cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP protein level were significantly increased (P<0.001) compared with the control group. After caffeic acid treatment, cell gap was reduced, adherence was tight, cell viability was significantly increased (P<0.001). Caffeic acid significantly reduced zearalenone-induced increase in caspase-3 mRNA, and cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP protein expression level (P<0.001). This study indicated that caffeic acid can restore granulosa cell viability by inhibiting ZEA-induced apoptosis.     

咖啡酸对玉米赤霉烯酮诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

卵巢颗粒细胞通过与卵母细胞相互作用及其自身分泌作用为卵泡的形成和发育成熟提供特殊的微环境。多种有害刺激可引起颗粒细胞凋亡和代谢失调从而降低卵母细胞质量,对胚胎的形成产生负面影响。玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是畜禽养殖业中常见的造成卵巢颗粒细胞损伤的霉菌毒素,且缺少有效治疗药物。因此,本试验用ZEA造成小鼠卵巢颗粒细胞损伤,探究咖啡酸对ZEA诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。通过机械法分离小鼠卵巢颗粒细胞;运用间接免疫荧光法对分离出的细胞进行鉴定;使用MTT法测定咖啡酸对正常小鼠卵巢颗粒细胞活性的影响;选取200、100和50 μg·mL^-1咖啡酸分别与ZEA共处理颗粒细胞,同时设置细胞对照组和ZEA模型组,24 h后显微镜观察细胞形态及贴壁情况,MTT法检测细胞活力;qRT-PCR技术检测caspase-3 mRNA的表达;Western blot检测cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白水平。结果发现,FSHR阳性染色大量出现在试验组细胞胞浆中,提示分离到的细胞是小鼠卵巢颗粒细胞;咖啡酸对卵巢颗粒细胞没有毒性作用且细胞活力均在90%以上;与空白对照组细胞相比,ZEA组细胞体积较小,贴壁较差,细胞间隙增大,细胞活力显著降低（P<0.001）,caspase-3 mRNA相对表达量以及cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白表达水平显著升高（P<0.001）,而给予咖啡酸处理后细胞间隙减小,贴壁紧密,细胞活力显著升高（P<0.001）,显著降低ZEA诱导的caspase-3 mRNA含量增加（P<0.001）,显著降低凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达（P<0.001）。本研究发现,咖啡酸可通过抑制ZEA诱导的细胞凋亡,恢复颗粒细胞活性。     

花生四烯酸对家禽卵泡颗粒细胞的影响

花生四烯酸是一类顺式多不饱和脂肪酸,是动物细胞膜磷脂的重要组成部分。在家禽生产中,花生四烯酸作为一种必需脂肪酸调控家禽的生长发育;而且作为功能性营养因子,通过在禽蛋中的蓄积来满足人体需求。除了作为前列腺素合成的前体物调节动物生殖过程外,花生四烯酸在调节卵泡颗粒细胞功能的过程中也起重要作用。