抑制素α-亚基成熟区基因在大肠杆菌中的原核表达

本试验成功获得抑制素α-亚基编码序列的克隆载体后,从阳性细菌中提取质粒,经SacI和XhoI酶切,回收354bp目的片段,与表达载体pET-32a连接,将构建好的pET32a(+)-INH-α原核表达质粒转化到受体菌E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,Tricine-SDS-PAGP电泳鉴定,检测到仔鹅与东北白鹅抑制素-α成熟区基因的表达。     

肉牛CAST基因5'UTR和3'UTR多态性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)专一抑制钙蛋白酶(Calpain,CAPN)活性,参与调节牛肉的嫩化及肌内蛋白的水解,其编码基因是肉质性状的主要候选基因。本研究根据牛CAST基因5'UTR区(GenBank No.AY834771)和3'UTR区(Gen Bank No.DQ991097)序列设计两对引物,用PCR-SSCP方法对鲁西黄牛和渤海黑牛共305个样本进行了单核苷酸多态性分析。结果显示,CAST基因5'UTR和3'UTR区存在PCR-SSCP多态,在5'UTR区存在6437(C/T)、6477(G/A)和6614(G/T)3个SNP位点,表现为AA、AB、BB、BC和AD 5种基因型;在3'UTR区存在359(T/C)和366(A/G)2个SNP位点,表现为EE、EF、FF和EG 4种基因型。经检验表明,鲁西黄牛和渤海黑牛均处于非Hardy-Weinberg平衡状态;群体遗传多态性分析表明这两种牛的多态信息含量均为中度多态。     

苏淮猪BMP4基因3'-UTR区克隆和多态性分析

[目的]本试验旨在研究梅山猪和苏淮猪BMP4(bone morphogenetic protein 4)基因3'-UTR区序列特征,分析苏淮猪BMP4基因3'-UTR区SNP位点并了解苏淮猪和高繁殖力猪种梅山猪BMP4基因3'-UTR SNP位点多态性。[方法]采用克隆测序技术获得苏淮猪BMP4基因3'-UTR区序列;利用生物信息学方法分析其序列特征;利用池DNA测序技术筛选SNPs,采用AS-PCR技术分析苏淮猪和梅山猪SNPs位点多态性。[结果]苏淮猪BMP4基因3'-UTR区序列长度为267 bp,含有一个(AC)9微卫星位点和Poly A结构;在苏淮猪BMP4基因3'-UTR区20 nt处发现一个SNP,AS-PCR检测到3种基因型(GG、GC和CC);在苏淮猪中,GG型和G等位基因为优势基因型和优势等位基因,频率分别为0.815和0.887,而在高繁殖力猪种梅山猪中CC型和C等位基因为优势基因型和优势等位基因,频率分别为为0.667和0.770。[结论]获得了BMP4基因3'-UTR区序列,鉴定了一个新的SNP位点,发现BMP4基因3'-UTR区20GC位点多态性可能与猪繁殖性能有关。     

猪抑制素α亚基基因克隆及其原核表达

为了克隆猪抑制素α亚基基因和表达其重组蛋白质,本试验采集发情期蓝塘猪卵巢组织,并从中快速抽提总RNA,以此作为模板并根据猪抑制素α亚基基因编码区序列(GenBank号:NM214189)设计合成1对引物,经反转录扩增获得了猪抑制素α亚基基因编码区全长序列。另外,再设计1对特异性引物以扩增抑制素α亚基成熟肽cDNA,并将扩增产物克隆到表达载体pRSET A的BglⅡ和EcoR I酶切位点之间,构建重组质粒pINH-SCAU并转化Escherichia.coli BL21(DE3)株。转化重组质粒pINH-SCAU的重组菌经IPTG诱导后表达的重组蛋白质分子量为20 000,经Ni-NTA凝胶纯化和兔抗牛抑制素α亚基抗体的特异性免疫反应,证明为抑制素α亚基重组融合蛋白质。对蛋白质表达条件的比较,结果显示重组菌经常规诱导剂0.05 mmol/L IPTG诱导5 h后的细菌生长密度OD600值为2,抑制素α亚基重组融合蛋白质的最高表达量为总菌体蛋白质量的32.00%。采用自动诱导培养基替代IPTG,在诱导18 h后能使菌液的OD600达13,同时自动诱导的抑制素融合蛋白质表达量占菌体总蛋白质的32.57%。因此利用自动诱导培养基可以获得较佳的抑制素重组整合蛋白质。     

苏淮猪BMP7基因3′-UTR多态性分析

[目的]本研究旨在了解苏淮猪骨形态发生蛋白7(BMP7)基因3′-UTR序列特征,以及突变位点多态性与繁殖性状、3′-UTR活性的关系,为解析猪BMP7基因3′-UTR的调控机制提供参考.[方法]采用PCR扩增和测序等技术获得苏淮猪BMP7基因3′-UTR序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;池DNA测序筛选苏淮猪B...     

野猪·家猪及其杂种猪 ACSL4基因3'UTR区多态性分析

[目的]为猪的分子育种研究提供理论依据.[方法]采用酚-氯仿法从野猪、民猪、大白猪、长白猪、杜洛克和杂种猪的耳组织中提取基因组DNA,根据CenBank上猪ACSL4基因cDNA全序列设计3对引物,进行PCR-SSCP和测序,分析ACSL4基因3UTR区的多态性.[结果]3对引物中,仅K3引物的PCR-SSCP产物有多态性,检测到3种基因型(AA、BB和AB).在ACSL4基因3'UTR区3 862 bp处发生T→C碱基突变.仅在大白猪、长白猪,杜洛克和杂种猪中发现多态性位点,而在民猪和野猪中未发现.杜洛克、大白猪和杂种猪间不同基因型的分布都有极显著差异(P<0.01),长白猪和大白猪各基因型的分布无显著差异(P>0.05).[结论]该研究为丰富猪种的种质特性资料库和充分利用种质资源提供了依据.     

猪myostatin基因5’调控区的酶切多态性分析

用 PCR- RFLPs分析方法 ,对长白、大白、杜洛克、军牧 号、民猪 5个猪种的 myostatin基因 5’调控区进行了酶切多态性分析。结果表明 ,长白、大白、杜洛克以等位基因 T为主 ,检测的 4 0头军牧 号的等位基因全部是 T,民猪 3种基因型均有 ,且频率近乎相等。统计分析表明 ,3种基因型的分布在长白、大白、杜洛克、军牧 号间差异不显著 ,而民猪同这 4个品种间的差异极显著     

H-FABP和HSL基因多态性对苏淮猪胴体性状的影响

应用PCR—RFLP方法检测了H-FABP、HSL基因在83头苏淮猪中的多态性分布。结果表明：H-FABP基因的3个变异位点和HSL基因都存在多态性。H-FABPHinfI位点HH基因型个体的背膘厚为19．81mm,极显著低于hh基因型个体（20．16mm）（P〈0．01）,Hh基因型个体的背膘厚为19．86mm,显著低于hh基因型个体（P〈0．05）。HH基因型个体的瘦肉率为59．69％,极显著高于hh型个体（54．84％）（P〈0．01）,Hh基因型个体的瘦肉率为58．69％,显著高于hh型个体（P〈0．05）。HH—Dd—Aa单倍型背膘最薄（19．73mm）、瘦肉率最高（60．92％）,但没有达到显著水平。HSL基因GG基因型个体的背膘厚为19．79mm,极显著低于AA基因型个体（20．23mm）（P〈0．01）,AG基因型个体的背膘厚为19．88mm,显著低于AA基因型个体（P〈0．05）。GG基因型个体的瘦肉率为59．89％,极显著高于AA型个体（54．04％）（P〈0．01）,AG基因型个体的瘦肉率为58．52％,显著高于AA型个体（P〈0．05）。提示：H-FABP、HSL基因可以作为胴体性状的候选基因用于猪的辅助选育。     

猪肿瘤坏死因子α基因5'侧翼区域多态性分析

利用直接测序法研究猪肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)基因5'侧翼区域多态性,并作多态位点与仔猪腹泻和生长性状关联分析。发现在TNF-α基因5'侧翼区域存在6个SNPs位点,建立针对SNP:-1048T/C和SNP:-1016A/G的Hha ⅠPCR-RFLP和Taq Ⅰ PCR-RFLP分型技术。Hha ⅠPCR-RFLP研究发现,在民猪群体中存在TC和CC两种基因型,在长白猪群体中存在TT、TC和CC三种基因型。Taq Ⅰ PCR-RFLP研究发现,在民猪和长白猪群体中仅存在AG和GG两种基因型。性状关联分析结果表明,TC比CC基因型民猪具有较高的35日龄断奶重(P0.05)和日增重(P0.05);TT基因型长白猪腹泻指数高于TC基因型个体(P=0.06)和CC个体(P=0.06);TT基因型长白猪出生重显著高于TC和CC基因型长白猪(P0.05)。结果表明,猪TNF-α基因对仔猪腹泻和生长性状有一定影响,但HhaⅠ位点能否作为新遗传标记有待进一步研究。     

基于PCR-RFLP技术分析H-FABP基因在5个猪群体中的多态性

【目的】肉质是猪肉的重要经济指标,肌内脂肪(IMF)含量是影响肉质的重要因素。H-FABP基因是调控猪肉IMF含量的候选基因。【方法】本实验采用PCR-RFLP技术分析H-FABP基因多态性,并检测该基因在5个猪群体:杜洛克(100头)、长白(80头)、大白(150头)、申农(80头)、梅山(140头)的基因型和基因频率。【结果】H-FABP基因在杜洛克、大白、申农猪群体中检测出DD、Dd和dd 3种基因型。在杜洛克群体中的基因型频率:DD(0.02)、Dd(0.23)和dd(0.75);在大白猪群体中基因型频率DD∶(0.25)、Dd(0.49)和dd(0.26);在申农猪群体中基因型频率:DD(0.10)、Dd(0.30)和dd(0.60)。在长白猪群体中检测的所有样品为dd型;在梅山猪群体中检测的所有样品为DD型。【结论】H-FABP基因在5个猪群体中呈现不同基因型。在长白猪和梅山猪群体中呈现偏态现象。在杜洛克和申农猪群体中主要为dd型,在大白群体中主要为Dd型。     

溆浦鹅卵泡抑制素α亚基克隆载体构建

利用RT-PCR技术从敏浦鹅卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出了抑制素α亚基成熟区序列,经RCR扩增出354bp片段,该片段与pMD-18T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定,并进行了测序分析,得到的克隆序列与设计的序列基本一致。表明已成功地获得了抑制素α亚基编码序列的克隆载体。     

猪肌肉生长抑制素基因5''''-调控区的突变与生产性能的相关分析

生长性状是猪育种中选择的主要目标性状之一。研究影响生长速度的基因或QTL具有重要的实践意义和理论价值。运用PCR-SSCP技术对猪肌肉生长抑制素基因(myostatin)5′-调控区的突变与部分生产性能(初生重和断奶重)的关系进行了分析。结果表明:MSTN基因型对初生重影响显著,对断奶重影响不显著。     

猪ME1基因3'UTR单核苷酸多态性对肉质性状的影响

采用PCR-SSCP技术分析了猪苹果酸酶1(ME1)基因3'UTR在杜洛克(Duroc)、长白猪(Landrace)、皮特兰(Pietrain)、金华猪(Jianhua)和野猪(wild boar)中的多态性,在猪苹果酸酶1基因3'UTR长298bp的序列中发现3处突变(C138T、G194T和A239C),它们组成3种基因型(CC GG AA、CT GT AC和TT TT CC),x2独立性检验结果表明这3种基因型在各品种闻差异显著(P＜0.05).对全华×皮特兰F2资源家系猪进行了该多态片段的基因型鉴定,并分析了不同基因型对猪肉质性状的遗传效应.结果显示,在眼肌pH45、腿臀肌肉pH45以及肌内脂肪含量这3个指标上,TT TT CC基因型猪分别比CC GG AA基因型猪高0.19%、0.17%和0.79%,差异显著(P＜0.05). R长298bp的序列中发现3处突变(C138T、G194T和A239C),它们组成3种基因型(CC GG AA、CT GT AC和TT TT CC),x2独立性检验结果表明这3种基因型在各品种闻差异显著(P＜0.05).对全华×皮特兰F2资源家系猪进行了该多态片段的基因型鉴定 并分析了不同基因型对猪肉质性状的遗传效应.结果显示,在眼肌pH45、腿臀肌肉pH45     

苏淮猪VRTN基因克隆、组织表达特征与多态性分析

【目的】获得苏淮猪VRTN基因编码区序列,了解其序列特征和组织表达特征,分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性。【方法】以苏淮猪卵巢组织cDNA为模板,采用克隆测序技术分离获得苏淮猪VRTN基因编码区序列。利用BioEdit 7.0软件分析其序列特征和蛋白理化性质。利用Clustal W软件进行核苷酸和蛋白质序列比对分析。利用UCSC基因组浏览器与NCBI基因组数据库进行猪VRTN基因的染色体定位和基因组结构分析。利用SMART软件预测蛋白质功能域,CPHmodels软件预测蛋白质三级结构。随机选取3头成年苏淮猪母猪,屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、肌肉和卵巢等组织,提取组织总RNA,采用RT-PCR技术分析苏淮猪VRTN基因的组织表达谱。采集106头成年苏淮猪繁殖母猪耳组织样,提取基因组DNA,采用 PCR-凝胶电泳分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性。【结果】苏淮猪VRTN基因编码区序列全长为2 097bp,与其它哺乳动物如人、小鼠、牛和羊的一致性分别为84.98%、74.53%、85.84%和86.45%,而与鸡的一致性只有54.42%。基因组结构分析发现猪VRTN基因由2个外显子和1个内含子构成,定位在猪7号染色体上。苏淮猪VRTN基因编码蛋白含有698个氨基酸残基,与人、小鼠、牛和羊等的一致性分别为85.55%、70.07%、86.20%和86.06%,但与鸡的一致性只有51.17%,可见哺乳动物VRTN基因在进化过程中比较保守。氨基酸组分分析显示苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20种氨基酸,其中Leu（亮氨酸）含量最高,达到10.44%,而Asp天冬氨酸含量最低,只有1.43%。蛋白结构分析发现苏淮猪VRTN蛋白含有 HTH结构域等典型结构域,由6个α螺旋、5个β折叠以及若干无规则卷曲组成。RT-PCR分析表明VRTN基因在苏淮猪心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、卵巢和肌肉组织等组织中均有表达,说明VRTN基因是一个广泛表达的基因。在苏淮猪群体中检测到VRTN基因ins291位点的3种基因型,其中仅有93bp条带的为野生纯合型（wt/wt）,仅有384bp条带的为突变纯合型（Q/Q）,含有384和93bp条带的为杂合型（wt/Q）。在苏淮猪群体中wt/wt型为优势基因型,基因型频率为0.717;wt为优势等位基因,基因频率是0.816;高脊椎数等位基因Q的频率为0.184。遗传多态性分析发现苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态信息含量为0.331,为中度多态位点,杂合度为0.40,变异程度相对较低。【结论】 获得了苏淮猪VRTN基因序列,其表达无组织特异性;苏淮猪群体中存在高脊椎数等位基因Q。     

猪Myf5基因外显子1的多态性分析

利用PCR-SSCP技术,以民猪、三江白猪、大白猪、长白猪、军牧1号、杜洛克和双肌臀大白猪共7个猪种为研究对象,根据GenBank上猪的Myf5基因外显子1序列设计了4对引物,进行了SNPs检测,并检测到了多态,发现在1 288 bp处有一个点突变G→C。经计算各基因型频率、基因频率和试验统计表明:随民猪、三江白猪、大白猪、长白猪、军牧1号、杜洛克和双肌臀大白猪瘦肉率的升高,等位基因M的基因频率也大致按此顺序呈上升趋势。     

抑制素α亚基在大鼠下丘脑与垂体的免疫组织化学定位

 用链酶亲和素-生物素过氧化物酶复合物（SABC）免疫组织化学方法，使用抑制素α亚基单克隆抗体对注射抑制素α片段及抑制素粗提物后的去卵巢大鼠的下丘脑和垂体进行了免疫组织化学定位。结果表明，在下丘脑与垂体存在抑制素α亚基单克隆抗体的特异性阳性反应位点，并存在剂量与时间上的依赖关系，说明抑制素α亚基可以通过血脑屏障到达下丘脑和垂体，为探讨抑制素α亚基在血脑屏障的转运机制提供了形态学上的依据。     

畜禽肌肉生成抑制素基因多态性研究进展

肌肉生成抑制素属于TGFβ超家族成员,该基因功能缺失性突变的个体表现出肌纤维数量和直径显著增大,导致肌肉产量显著增加。总结了MSTN基因在鸡、猪、牛、羊上多态性的研究进展。     

鸭肌肉生长抑制素基因的多态性

为了研究肌肉生长抑制素基因(MSTN)在鸭群体中的遗传变异情况,本试验以莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、建昌鸭及北京鸭为材料,运用连接酶检测反应(PCR-LDR)的方法对MSTN基因5′-调控区C1024GSNP位点进行基因分析,并分析了该位点在群体中的基因型频率、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡情况.结果表明:MSTN基因C1024G位点在7个鸭品种中均检测到CC、CG和GG 3种基因型.在连城白鸭、攸县麻鸭和高邮鸭中,基因型CC占优势,且以连城白鸭为最高(0.72);在莆田黑鸭和建昌鸭中,基因型CG占优势;在高邮鸭中,基因型GG占优势,而其他鸭品种中基因型GG比例均较低;在绍兴鸭中基因型CC、CG出现的频率相同.建昌鸭和北京鸭中等位基因G的频率高于等位基因C的频率,其他鸭品种中均为等位基因C的频率大于等位基因G的频率.莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、北京鸭和高邮鸭MSTN基因在1 024位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),仅建昌鸭不符合Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05).     

三个山羊群体抑制素-α 5′区的单核苷酸多态性分析

采用PCR-SSCP技术检测抑制素α(Inhibin-α,INHA)基因5调控区在高繁殖力山羊品种(黄淮山羊和长江三角洲白山羊)以及低繁殖力品种(波尔山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对黄淮山羊繁殖力的影响.设计3对引物扩增山羊INHA基因5′调控区序列,只有引物2在3个山羊群体中检测到多态性,出现了3种基因型(AA、AB、BB),测序结果表明BB 型和AA 型在INHA基因5′调控区都发生了2处碱基突变(260G→T和353 A缺失).黄淮山羊突变纯合型(BB)和突变杂合型(AB)平均产羔数分别比野生型(AA)多1.25 只(P<0.01)和0.78 只(P<0.05).初步表明,INHA基因可能是影响黄淮山羊高繁殖力的一个主效基因或是与其存在紧密遗传连锁的一个分子标记.     

猪肌肉生长抑制素基因5’-调控区的突变与生产性能的相关分析

生长性状是猪育种中选择的主要目标性状之一。研究影响生长速度的基因或QTL具有重要的实践意义和理论价值。运用PCR—SSCP技术对猪肌肉生长抑制素基因（myostatin）5’-调控区的突变与部分生产性能（初生重和断奶重）的关系进行了分析。结果表明：MSTN基因型对初生重影响显著，对断奶重影响不显著。