农杆菌介导薄皮甜瓜遗传转化体系建立

以薄皮甜瓜"M15"和"M43"子叶节为外植体,研究激素浓度、卡那霉素浓度和消毒时间等对甜瓜子叶节再生及农杆菌介导遗传转化的影响。结果表明,诱导甜瓜子叶节不定芽分化最佳激素组合为0.5 mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)IAA,芽伸长激素为0.05 mg·L~(-1)6-BA,生根激素为0.1 mg·L~(-1)IAA。农杆菌介导甜瓜转化最佳条件为预培养48 h,OD_(600)=0.6农杆菌菌液侵染15 min,黑暗条件下共培养48～72 h,头孢抑菌浓度500 mg·L~(-1),卡那霉素浓度75 mg·L~(-1)。PCR检测卡那霉素抗性苗,验证外源基因已整合进入甜瓜基因组,"M15"和"M43"抗性植株阳性率分别为84.2%和77.4%。     

蝴蝶兰高效再生体系与遗传转化体系的建立

为建立蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)再生体系和遗传转化体系,对蝴蝶兰进行人工授粉,成熟后将胚播种于诱导培养基上诱导原球茎或不定芽。探讨外源调节剂的种类及浓度,并筛选卡那霉素浓度以及除菌剂的种类及浓度。结果表明:当6-BA浓度为5 mg·L~(~(-1)),NAA浓度为1 mg·L~(-1)时,原球茎的诱导效率最高。当6-BA浓度为1.5mg·L~(-1),同时添加0.5g·L~(-1)活性炭和40mL·L~(-1)椰汁时,壮苗效果最佳。卡那霉素的筛选浓度为4mg·L~(-1),除菌剂的种类为阿莫西林克拉维酸钾(7∶1),除菌浓度为100mg·L~(-1)。     

胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立

胡萝卜是一种重要的世界性蔬菜，其丰富的营养成分、高β－胡萝卜素及鲜食特性，使之成为植物反应器的理想作物。本研究以栽培品种“新黑田五寸人参”为材料，研究了胡萝卜组织培养及遗传转化体系。得到了如下结论，愈伤诱导培养基及继代培养基为B5附加0.5mg/L2,4-D和0.5mg/L 6-BA，最适于转化的外植体为弱光下萌发的7－10天龄无菌苗之下胚轴，最适卡那霉素浓度为100mg/L，添加低浓度的乙酰丁香酮（25μM）有利转化，抗性植株再生时，除去抗生素有利于植株再生。     

大红甜橙遗传转化高效再生体系的建立

以大红甜橙的实生苗为试材,研究6-BA与IAA的不同浓度组合和Km不同浓度对大红甜橙不同外植体离体再生的影响和IBA的不同浓度对不定芽生根的影响,建立了高效的大红甜橙遗传转化再生体系.该体系的最佳条件是:1)以实生苗上胚轴为外植体.2)以MS无机盐 100mg/L肌醇 0.2mg/LV-B1 1mg/LV-B6 1mg/L烟酸 3%蔗糖 0.8%琼脂(pH5.8) 3mg/L6-BA为不定芽诱导培养基,在26℃黑暗条件下培养7d后,转移至光/暗周期16/8h的条件下诱导不定芽的分化(40d分化率达90%).以1/2MS 3%蔗糖 0.7%琼脂 2.0mg/LIBA为不定芽的生根培养基(40d生根率达94.7%).3)筛选遗传转化转化体的Km质量浓度为50mg/L.     

黄瓜再生体系和遗传转化的建立

以黄瓜（Cucumis sativus L.）哈研3号为试验材料,采用组织培养技术系统探讨以子叶或子叶节为外植体时不定芽的诱导效率,最终确定以子叶节作为再生体系及遗传转化体系的试验材料;并系统探讨了不同PGRs浓度对不定芽诱导、不定芽伸长及生根阶段的影响;建立了哈研3号黄瓜的高频再生体系;并在子叶节根端膨大阶段进行了抗生素（Km）浓度的摸索,建立了较为适宜的遗传转化体系,为转基因工作打下坚实的基础。     

甜瓜叶片高效再生体系的建立

为了建立高效稳定的甜瓜植株再生体系,为甜瓜的转基因技术提供受体材料,以薄皮甜瓜品种"西甜一号"叶片为外植体,通过器官发生途径诱导形成不定芽,研究了不同的激素组合、外植体放置方式、暗培养时间等条件对其再生的影响。结果表明,以新梢顶端展开的第2~3片叶在MS 6-BA1.0 mg/L的诱导培养基上,外植体远轴面向下接触培养基,直接转入正常光周期下培养再生频率可达100%,平均每个外植体上可诱导出11株健壮植株。在MS 6-BA 0.05 mg/L不定芽伸长培养基上,分化的不定芽(丛)能够伸长。在1/2MS IAA 0.2 mg/L的生根培养基上无根苗生根,生根率可达100%。     

厚皮甜瓜高效再生体系的建立

以优质厚皮甜瓜品种鲁厚甜2号和鲁厚甜4号为材料,系统研究了以子叶为外植体的厚皮甜瓜组培高效再生体系。结果表明:两个甜瓜品种在不定芽和愈伤组织诱导上存在着较大的差异,在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L的分化培养基上,鲁厚甜2号不定芽诱导率最高达92.6%;而鲁厚甜4号在MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L中达94.3%;诱导出的不定芽丛的伸长以MS+KT 0.2 mg/L为最佳;两个甜瓜品种在1/2MS+IBA 0.4 mg/L中均获得良好的生根效果。另外,保持高温、高湿是甜瓜再生苗移栽成活的重要条件。     

黄瓜子叶高效再生体系的建立与遗传转化

实验以S05、S062个黄瓜品系的子叶为外植体,以MS为基本培养基,添加不同浓度的BA、ABA、AgNO3进行再生培养。结果表明,在MS培养基上,ABA与BA组合能有效地抑制愈伤组织的形成,促进芽的发生,其再生率超过90%,每个外植体的出芽数为1～3个。S05、S06的最佳芽诱导培养基分别为:MS BA3.0mg·L-1 ABA1.0mg·L-1 AgNO32.0mg·L-1和MS BA1.5mg·L-1 ABA0.5mg·L-1 AgNO32.0mg·L-1。在此基础上,以S06子叶为受体材料,建立了pBI121-ATT1为中间载体,根癌农杆菌LBA4404介导的遗传转化体系,最终获得了3株抗性植株,经过PCR检测,初步确定均为阳性转化植株。     

芍药遗传转化再生体系的建立

以芍药为研究对象,建立芍药高效的遗传转化再生体系,试验筛选最佳结果为：以茎段为外植体,用HgCl2消毒15min,基本培养基为1／2MS,抗坏血酸（100mg·L^-1）,诱导愈伤阶段的植物生长调节剂（PGR）配比为ZT（2．0mg·L^-1）＋IAA（0．4mg·L^-1）,胚状体分化阶段不加植物生长调节剂PGR;生根阶段为IAA（0．4mg·L^-1）。抗性筛选时适宜的卡那霉素Km浓度为4mg·L^-1,遗传转化受体为胚性愈伤组织。     

甘菊遗传转化再生体系的建立

[目的] 建立高效稳定的甘菊再生体系,并确定卡那霉素和草丁膦的筛选压。[方法] 以甘菊无菌苗叶片为外植体,通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系。[结果] 在5种芽诱导培养基中,MS3（MS＋NAA 0.1mg/L＋6-BA0.1mg/L）的再生频率最高,可达98%,其不定芽生根率可达100%。培养35d后,添加5和10mg/L卡那霉素的培养基上甘菊再生率为11.3%和10%,添加15和20mg/L卡那霉素的培养基上没有芽的分化;添加0.5mg/L草丁膦的培养基上甘菊再生率为8.7%,添加1mg/L草丁膦的培养基上没有芽的再生,添加1.5和2.0mg/L草丁膦的培养基上没有芽的分化。卡那霉素和草丁膦在甘菊遗传转化中的筛选浓度分别为8.0和0.8 mg/L。[结论] 该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。     

芍药遗传转化再生体系的建立

以芍药为研究对象,建立芍药高效的遗传转化再生体系,试验筛选最佳结果为:以茎段为外植体,用HgCl2消毒15min,基本培养基为1/2MS,抗坏血酸(100mg·L-)1,诱导愈伤阶段的植物生长调节剂(PGR)配比为ZT(2.0mg·L-1)+IAA(0.4mg·L-)1,胚状体分化阶段不加植物生长调节剂PGR;生根阶段为IAA(0.4mg·L-)1。抗性筛选时适宜的卡那霉素Km浓度为4mg·L-1,遗传转化受体为胚性愈伤组织。     

菊花高效瞬时转化体系建立及稳定遗传植株再生

[目的]本试验的目的是通过瞬时转化解决菊花转基因中存在的两大难题:转化效率低和表达水平低。[方法]通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因(编码β-葡糖苷酸酶)的表达载体pORE R1-2×35S∷GUS转入菊花‘优香’叶片中,进行瞬时表达,并组织培养转化后的叶片,利用GUS化学染色法和RT-PCR进行转化植株鉴定。[结果]菊花‘优香’瞬时表达的转化效率高达76.7%,外源基因(GUS)的表达水平也较理想,尤以第4和第5片完全展开叶(从形态学上端向形态学下端数)表现最佳。经过3~4个月的组织培养和抗性筛选,瞬时转化的‘优香’叶片再生出稳定遗传的转基因株系,转化效率达38.9%。[结论]本试验提供的菊花瞬时表达的方法高效、简单,并能实现稳定遗传。     

加工番茄遗传转化再生体系的建立

加工番茄种子出芽后7~8 d,子叶剪成约0.2~0.4 cm,0.3~0.5 cm的小块,以MS B5为基本培养基,附加IAA0.2 mg/L分别与0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L的6-BA/ZT/TDZ组合;6-BA2.0 mg/L分别与0.0,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0 mg/L的IAA/IBA/NAA组合。经诱芽比较,在不同浓度6-BA/ZT/TDZ与0.2mg/LIAA组合中,出芽率最高的培养基为MS ZT1.0 mg/L IAA0.2 mg/L和MS TDZ2.0 mg/L IAA0.2 mg/L。在不同浓度的IAA/IBA/NAA与6-BA2.0 mg/L组合中,IAA明显优于NAA和IBA,筛选出MS 2.0 mg/L6-BA 1.0 mg/LIAA为最佳生芽培养基。以1/2MS添加NAA//BA0.0,0.1,0.2,0.5,1.0 mg/L进行生根比较,再生芽在MS 0.5 mg/L IBA生根培养基上生根最好,并发育成完整的小植株。     

籼稻遗传转化高频再生体系的建立

选用21个籼稻品种进行成熟胚离体培养试验，结果发现大多数品种可通过添加一定配比的外源植物激素使愈伤组织诱导率大大提高，继代培养基中添加KT NAA可明显改善愈伤组织的生长状况；连续继代可显著提高愈伤组织的再分化率；预分化培养后转入再分化培养可显著提高愈伤组织再分化率，建立了一套适于籼稻遗传转化的高频再生离体培养体系。     

甜瓜再生体系的建立

[目的]建立甜瓜再生体系。[方法]以加格达甜瓜为材料,以MS培养基为基本培养基,根据植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导分化的决定性作用,通过设计不同生长素和细胞分裂素的组合与不同浓度配比,研究建立和优化高效的加格达甜瓜再生体系。[结果]愈伤组织诱导培养基:MS+2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L,出愈率93%;芽诱导培养基:MS+6-BA 2.0 mg/L,出愈率76%,出芽率100%;芽的分化培养基:MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA0.2 mg/L,分化率为95%;芽的伸长培养基为:MS+6-BAI 0.05 mg/L;根的诱导培养基为:MS+IAA0.2 mg/L。[结论]建立了1套甜瓜的离体再生体系,为利用转基因技术培育出具有抗病虫害、抗逆性等优良性状的甜瓜奠定基础,在理论和实践上均具有重要的意义。     

甜瓜自交系‘羊角蜜’植株再生及遗传转化体系的建立

组培再生体系是进行植物遗传转化、开展功能基因组学研究的前提条件,然而目前甜瓜的组培再生及遗传转化体系仍不成熟,限制了该领域基因的功能研究和育种应用。本研究以薄皮甜瓜(Cucumis melo L.)自交系‘羊角蜜(YJM)’为试材,系统比较和分析了外植体类型、基础培养基、激素浓度、抗生素和农杆菌菌株等因素对其组培再生和遗传转化的影响。结果表明播种后2 d子叶节的不定芽分化率显著高于5 d后子叶节和下胚轴;相较B5、N6、WHITE和SH四种诱导培养基,外植体在MS或LS上具有更高的愈伤诱导率及不定芽分化率;当培养基中6-BA浓度为0.5 mg L^-1时,不定芽诱导率最高、生长状态最好;据此提出‘YJM’播种后2 d子叶节的最佳诱导培养基配方为(MS/LS基础培养基+0.5 mg·L^-1 6-BA+1 mg·L^-1 ABA+30 g·L^-1蔗糖+9 g·L^-1 Agar)。随后,我们比较了三种生根培养基(MS+9 g·L^-1 Agar、MS+0.5 mg·L...     

京玉1号甜瓜高效再生体系的建立

以京玉1号甜瓜为材料,研究了外植体不同部位、苗龄、激素组合等因素对植株离体再生的影响,建立了以子叶为外植体的高效再生体系.结果表明:甜瓜子叶生长6 d时最佳,用Ms+6-BA 2.0 mg/L诱导分化培养基,不定芽诱导率可达88.67%;诱导不定芽伸长生长以MS+GA32 mg/L+KT 2 mg/L为最佳,伸长率达83.33%;伸长的不定芽在MS+IBA 0.5 mg/L上生根良好,外植体生根率达91.67%.     

以叶片为外植体建立三倍体毛白杨高效再生体系

[目的]建立三倍体毛白杨叶芽再生体系与探索抗生素对叶片再生不定芽的影响。[方法]以叶片为外植体,探索适合三倍体毛白杨遗传转化的再生条件和抗生素对叶片再生不定芽的影响。[结果]结果表明,三倍体毛白杨最适合的不定芽分化培养基配方为MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.50 mg/L;在基因工程中,40 mg/L的卡那霉素为选择性抗生素使用浓度,300 mg/L的头孢霉素为抑菌性抗生素使用浓度;再生的不定芽在MS+IBA 0.10 mg/L固体培养基中生根率可达82%。[结论]该研究为毛白杨遗传转化中适宜的培养基成分和抗生素浓度的选择提供科学依据。     

盆栽小菊高效遗传转化体系的建立

采用根癌农杆菌介导的叶圆片遗传转化方法,建立了盆栽小菊稳定而高效的遗传转化体系.试验结果表明:黑暗条件下预培养2d,根癌农杆菌A600约0.5、侵染10 min,共培养3 d,延迟培养5 d能获得较高的转化率;10～15 mg/L的潮霉素具有很好的筛选效果.获得的抗性芽再生植株经PCR检测,初步证实外源基因已转入受体植物的部分株系中.     

高效银耳芽孢遗传转化体系的建立

【目的】建立PEG介导的高效银耳（Tremella fuciformis）芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1（含有构巢曲霉gpd-An 启动子和潮霉素抗性基因hph）和pLg-hph（含香菇gpd-Le启动子和hph基因）转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50 µg•ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100 µg•ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进银耳芽孢的基因组中,其转化率为110个/µg DNA。而pAN7-1转化子经过PCR鉴定及Southern 杂交验证,结果表明只有部分转化子基因组中整合了hph基因,其转化率只有9个/µg DNA。银耳芽孢转化子在PDSA培养基中继代5次后仍检测到hph基因的存在,表明外源基因hph能在银耳芽孢继代中稳定遗传。【结论】25%的PEG4000能高效介导银耳原生质体的转化;香菇gpd-Le启动子是银耳芽孢表达外源hph基因的强启动子;外源hph基因能够在银耳芽孢继代培养中稳定遗传。