λgt10 cDNA文库表达序列标签测定时模板处理方式

表达序列标签是揭示基因组容量的有效方法.在构建cDNA文库的基础上,对以λgt10为载体进行表达序列标签测定时模板的处理方法进行了探讨.结果表明,以λ噬菌体DNA为模板直接测序比PCR产物经回收后为模板进行测序,其目标克隆的平均插入片段长度要长,但反应成功率低.以λ噬菌体浸提液为模板进行PCR并在产物回收后进行测序反应,可能是以λ噬菌体为载体构建文库的表达序列标签测定的最佳选择.     

ANXA2真核表达载体的构建

以膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)真核表达载体的构建过程为基础,介绍一种易于成功构建真核表达载体的方法。以Hela细胞来源的cDNA为模板,半套式PCR为基础,通过两次PCR的方法,可获得5’端添加Kozak序列并融合表达HA标签基因和ANXA2的基因片段Kozak-HA-ANXA2,回收后克隆到pMD-18T克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法将其克隆入慢病毒真核表达载体pTRIP中。结果显示,经双酶切和测序之后确定真核重组载体pTRIP-HA-humANXA2构建成功。通过半套式PCR方法构建真核表达载体成功率高,为下一步细胞表达试验创造条件。     

大肠杆菌铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与序列测定

试验以E.coliMG1655的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增sodC基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacI和KpnI酶切及PCR扩增鉴定,并对sodC基因片段进行序列测定。试验成功克隆了sodC基因,获得的基因与报道的sodC基因序列同源性达到99.6%,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

双峰驼clusterin基因的克隆及功能分析

为了研究双峰驼clusterin基因真核表达载体的构建及其生理功能,试验采用深圳华大公司提供的clusterin基因片段序列设计PCR引物,以双峰驼肾脏RNA反转录获得的cDNA为模板进行PCR,结合RACE技术获得基因编码序列,将测序结果正确的序列连入pEGFP-N1框架载体以构建真核表达载体,转染海拉细胞。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致并成功转染海拉细胞。说明双峰驼clusterin基因真核表达载体构建成功,并成功将骆驼clusterin基因转入海拉细胞,可用于进一步研究clusterin基因在体内的生理功能。     

鸡抗菌肽LEAP-2基因克隆及序列特征分析

Ⅱ型肝表达抗菌肽(LEAP-2)是近年来在脊椎动物中发现的一种新型抗菌肽,并具有较强的抗微生物活性.本研究旨在以艾维茵肉鸡为实验材料,提取鸡全血DNA,通过PCR方法扩增抗菌肽LEAP-2基因,将PCR产物回收后,转化至克隆载体进行DNA测序,并将测序结果与GenBank公布序列进行对比,用ScanProsite对其蛋白质序列进行生物学信息分析.结果表明:扩增产物为150 bp大小的片段,基因序列与GenBank公布序列同源性高达100％,编码48个氨基酸残基,具有3个结构功能区7个功能位点.本研究为进一步探讨LEAP-2的功能奠定了基础.     

分枝杆菌噬菌体CJAUS9 lysB基因的克隆与序列分析

参照GenBank中lysB基因序列设计特异引物,以耻垢分枝杆菌噬菌体CJAUS9的基因组为模板,PCR扩增出1029 bp的条带,经酶切、PCR鉴定含有目的基因的克隆载体pMD19-T正确后进行测序分析.结果显示,克隆出的lysB基因与已知分枝杆菌肌尾噬菌体lysB序列同源性为98.7％ ～99.1％;编码的氨基酸同源性为99％～100％,有酯酶保守的G-X-S-X-G基序,为研究LysB蛋白的生物学特性奠定了基础.     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

新城疫病毒感染性克隆全长cDNA转录载体的构建

以pEGFP-N1和pAdTrack-CMV质粒为模板,通过PCR扩增分别获得GFP基因序列和Kan基因序列;以胶回收的目的序列为模板,通过Overlap PCR扩增获得GFP-Kan基因序列。回收GFP-Kan基因序列,插入至pCI-neo载体上,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-GFP/Kan。再将设计合成的linker基因序列通过酶切、连接克隆至pCI-GFP/Kan载体上,涂布Kan抗性平板进行阳性克隆筛选,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-infect,即为新城疫病毒全长cDNA双启动子克隆载体。酶切和测序鉴定结果显示,pCI-infect载体构建成功。     

PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

以PRRSV细胞培养物为模板，经RT—PCR扩增得到ORF5／ORF6基因，该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切，连接构建pIRES-ORF5／ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5／ORF6。测得的ORF5／ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99％和100％，属北美洲型。     

捻转血矛线虫(H.contortus)ZJ株H11蛋白基因的克隆及序列分析

参照已发表的捻转血矛线虫H11蛋白基因序列设计引物，以H．contortuss ZJ株的总RNA为模板，进行RT—PCR扩增，成功扩增出H11基因。将PCR产物与pUCm—T载体连接后，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。序列分析表明，其核苷酸序列与国外报道的H11基因的同源性为99．5％。编码氨基酸序列具有氨基肽酶的保守序列，推测可使虫体不能获得所必需的氨基酸而导致死亡。     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPV-SF02毒株的基因组RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出HN基因片段，然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后，对阳性克隆进行测序；测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列，所测GPV-SF02毒株与参考毒株NL-96核苷酸序列的同源性为86%。     

phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建

直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板，对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增，再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒，经DNA测序鉴定正确后，亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e，成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建，为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。     

鸡组织细胞端粒相关序列的克隆及序列分析

根据真核细胞端粒DNA序列的共同特点，设计了一条引物（TELO02）（24nt)。按照TaKala克隆试剂盒的介绍方法，染色体基因组DNA经HaeⅢ和HinfⅠ两种限制性内切酶酶切后，先进行初级PCR（C1和TELO02）扩增，得到的产物为模板再经过次级PCR（C2和TELO2）扩增，得到的产物用试剂盒回收，并连接到PMD-18-T载体上，转化到JM109受体菌中，从阳性克隆中提取质粒DNA进行PCR和酶切鉴定，确认后进行序列测定，获得了一段243sbp的鸡端粒相关序列。此序列与人第7条染色体基因组末端序列的同源性为63.5%；与鼠端粒旁序列同源性为63.2%；而与MDV基因组序列的BamHⅠ酶切片段76.6%的同源。     

貂源绿脓杆菌流行株toxA基因克隆序列分析及原核表达

为了研究貂源绿脓杆菌流行株toxA基因的遗传变异情况,并将toxA基因进行原核表达,本试验以貂源绿脓杆菌DNA为模板,经PCR扩增表达外毒素A蛋白的toxA基因,约1 917 bp的片段,将产物克隆与pMD-18T载体并测序。结果表明,12株流行株的序列与GenBank中的标准产毒株PA103株和PA01株的遗传关系较近,显示外毒素A毒性的氨基酸均未发生突变,流行株变异不大。将该基因亚克隆到原核表达载体pET32a,转化BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度的IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western Blot鉴定,结果表明,可产生相对分子量约为78 kDa的表达产物,成功地构建了外毒素A蛋白的重组表达系统。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的克隆与序列测定

用PCR方法以伪狂犬病病毒闽A株的基因组DNA为模板扩增到了gE基因表位抗原决定域的编码区段。PCR产物连接到pMD18-T载体后，转化大肠杆菌XL1－blue菌株，重组质粒经测序并与GenBank中已登录的gE基因序列比较，确证含有PRV闽A株gE基因的表位抗原编码区，此区段与PRV Rice株相应区段的DNA序列同源性为97．3％，氨基酸序列同源性为94．7％。     

梅花鹿促卵泡激素α亚基基因克隆与融合表达

以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHα亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHα融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明,FSHα PCR产物大小约380 bp,测序结果与GenBank序列一致;重组表达载体pGEX-6P-2-FSHα构建成功;融合蛋白经SDS-PAGE分析,结果发现,在分子质量39.3 ku处出现特异性蛋白质条带,说明梅花鹿FSHα亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHα-GST融合蛋白。     

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK的表达及其多克隆抗体的制备

将噬菌体与细菌孵育25min提取噬菌体感染细菌的总RNA,通过逆转录的方法获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到目的片段,以pET-15b为载体构建重组质粒pET-15b-lysK并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达金黄色葡萄球菌噬菌体K裂解酶基因lysK,表达产物蛋白经镍柱纯化后,测定LysK的裂解活性、裂解谱,并免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明,成功诱导表达可溶性LysK并获得重组蛋白,酶谱试验证明LysK对金黄色葡萄球菌具有裂解活性,LysK比噬菌体K裂解谱广。制备的兔多克隆抗体能够与LysK发生特异性反应且具有较高效价,为后续进行LysK体内治疗研究打下了基础。     

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK的表达及其多克隆抗体的制备

将噬菌体与细菌孵育25min提取噬菌体感染细菌的总RNA,通过逆转录的方法获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到目的片段,以pET-15b为载体构建重组质粒pET-15b—lysK并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达金黄色葡萄球菌噬菌体K裂解酶基因lysK,表达产物蛋白经镍柱纯化后,测定LysK的裂解活性、裂解谱,并免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明,成功诱导表达可溶性LysK并获得重组蛋白,酶谱试验证明LysK对金黄色葡萄球菌具有裂解活性,LysK比噬菌体K裂解谱广。制备的兔多克隆抗体能够与LysK发生特异性反应且具有较高效价,为后续进行LysK体内治疗研究打下了基础。     

嗜酸乳杆菌的亚油酸异构酶基因克隆及其pMG36e表达载体的构建

以嗜酸乳杆菌基因组为模板,对亚油酸异构酶基因进行PCR,PCR产物克隆到pMD-19T质粒中,经菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定克隆成功后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建乳酸菌表达载体pMG36e-LAI并转化到大肠杆菌DH5α中,经菌落PCR和酶切分析初步证明表达载体pMG36e-LAI构建成功。该研究为利用工程菌工业化生产高产量、高活性亚油酸异构酶制剂来生产CLA奠定基础。     

猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带缃虫TS61抗原基因，与载体pUC18连接后进行测序；并构建了该基因的pGEX-1λT原核表达载体，制备了其原核表达产物，进行浓度梯度SDS－PAGE和免疫印迹分析，对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明，猪带绦虫TS61抗原基因含893对碱基，编码含70个氨基酸残基的多肽，分子质量为8.0ku，等电点为4.19。在基因库和欧洲分子学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为34ku，该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。