玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化

以玉米B73黄化苗叶片为研究材料，采用酶解法分离并获得高活性的玉米叶肉原生质体细胞，优化PEG-Ca²⁺介导的玉米叶肉原生质体细胞转化条件，探索电击介导玉米叶肉原生质体细胞瞬时转化方法。同时，以荧光蛋白为报告分子融合细胞器定位信号，建立玉米叶肉原生质体亚细胞定位系统，进一步验证该瞬时表达系统具备可用于基因功能研究的可能性。结果表明，通过酶解法分离获得的玉米叶肉原生质体细胞经过FDA染色统计发现，95%的细胞结构完整且活力较高。在PEG-Ca²⁺介导瞬时转化方法中，当PEG浓度40%且质粒量增加至25 μg时转化效率达到最高，为51.28%。在电击介导瞬时转化方法中，当电压为350 V且电击时间为5 ms的条件下电击转化效率最高，为32.66%。通过将核定位信号NLS与eGFP基因融合转入玉米叶肉原生质体细胞，eGFP成功定位于细胞核。通过将叶绿体定位基因ZmMSH1与DsRed2基因融合并转入，DsRed2蛋白成功定位于叶绿体中。在玉米叶肉原生质体细胞中过表达ZmDHDPS基因，通过qRT-PCR和Western Blot等技术确定了ZmDHDPS高表达活性，并显著提高原生质体细胞内游离赖氨酸含量。     

叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT在小麦遗传改良中的应用

为了解叶片衰老抑制基因 P_SAG12-IPT在小麦遗传改良中的作用,利用共表达P_SAG12和IPT的转基因小麦材料（T_IPT-XN1376）与推广小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023杂交,并对其后代进行分子标记辅助选择和叶绿素含量测定,研究 P_SAG12-IPT基因在小麦中的遗传特点及其与衰老和叶片叶绿素含量的关系。结果表明,150个转基因株系中,携带 P_SAG12-IPT植株与不携带 P_SAG12-IPT植株的分离比为110∶40,χ检验表明,符合3∶1的分离特点,说明 P_SAG12-IPT基因以单基因形式在子代中稳定遗传。携带 P_SAG12-IPT的F₂株系平均叶绿素含量（55.4 mg·g^-1）比不携带 P_SAG12-IPT的F₂株系（51.7 mg·g^-1）提高7%,说明 P_SAG12-IPT基因能够降低植株叶片叶绿素的降解速率,使叶片维持较长持绿时间,延缓叶片衰老。     

玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

低温胁迫及恢复对玉米光合特性的影响

以玉米自交系掖478、合344、吉853为材料,在不同低温胁迫及恢复正常温度情况下比较幼苗光合作用及叶绿素荧光参数等指标的变化。结果表明,随着胁迫温度的下降和低温胁迫时间的延长,3个玉米自交系幼苗叶片初始荧光F_o呈上升趋势,F_v/F_o、F_v/F_m整体上均呈下降趋势。叶绿素荧光参数随着低温胁迫程度的加强变化较大,且相同温度下的变化幅度掖478<合344<吉853。3个玉米自交系在各温度胁迫后恢复到常温时的叶片初始荧光F_o下降,F_v/F_m、F_v/F_o整体上呈上升趋势。掖478恢复常温1～2 d后恢复到正常水平,抗冷性最强;吉853的PSⅡ系统受损较重,恢复常温3 d未达正常水平,抗冷性较弱。     

玉米叶片水分利用效率与叶绿素a荧光参数的关系

利用Handy PEA植物效率仪测定叶绿素a荧光参数,研究玉米自交系叶片水分利用效率(WUE)与叶绿素a荧光参数的关系。结果表明,玉米自交系叶片WUE与叶绿素a荧光参数呈极显著的正相关。其中,F_o与高水分利用效率(HWUE)玉米自交系WUE的相关系数大于低水分利用效率(LWUE)玉米自交系WUE的相关系数;最大荧光(Fm)、可变荧光(F_v)、PSⅡ原初光能转换效率(F_v/F_m)和PSⅡ潜在活性(F_v/F_o)与水分利用效率不同的玉米自交系叶片WUE的相关系数恰好相反,这是造成不同玉米自交系WUE存在差异的生理原因之一,同时也说明叶绿素a荧光参数可以作为选育HWUE玉米自交系的重要指标。     

基于上部叶片叶绿素荧光参数的小麦产量预测与评价

为了利用叶绿素荧光快速测定技术实时评价植株光合生产能力以及预测小麦籽粒产量,以豫麦49-198和郑麦9694为试验材料,设置0、90、180、270 kg·hm^-24个氮素水平,通过2014-2016年连续两个生长季的田间试验,在小麦主要生育阶段同步测定植株顶部四片完全展开叶的净光合速率（P_n）、叶绿素荧光参数及叶面积。结果表明,P_n和叶绿素荧光参数因生育时期、氮素水平和叶片位置的不同呈现规律性变化。叶绿素荧光参数F_m′、F_v′、F_v′/F_m′ 和 F_s与P_n 相关性较好,且相关系数（r）均随叶位的降低而降低,其中,F_m′与P_n的相关性最好。将叶面积与对应的净光合速率和叶绿素荧光参数组合出光合性状累积量指标,与P_n 相比,光合累积量与产量的相关性显著提高。组合顶部四片叶,光合累积量与产量相关性在灌浆前期表现最好（r=0.875）。光适应下荧光参数累积量与产量的相关性表明,顶部两片叶的相关性较单叶片或其他叶位组合均表现较好,相关系数在不同荧光参数、生育时期间差异均较大,以F_m′表现最好,其次是F_v′;生育期间比较,孕穗期至灌浆中期整体较好。总体而言,在灌浆前期,顶部两片叶的F_m′累积量能够较好地预测小麦籽粒产量,为小麦生长诊断和田间管理提供技术支持。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

农杆菌介导法将抗草甘膦基因转入玉米自交系

利用农杆菌介导法将抗草甘膦基因(ssu-G₂-aroA)转入优良玉米自交系R18-599和齐319,侵染后的愈伤组织转至潮霉素浓度为10 mg/L的筛选培养基上,继代筛选3轮,每轮3周;得到的抗性愈伤组织在含有潮霉素浓度为3 mg/L的分化培养基上进行分化,R18-599获得30株再生植株,齐319获得18株再生植株。经PCR鉴定后共得到7株转化抗性植株(4株R18-599、3株齐319)。经PCR-Southern及RT-PCR检测结果表明,ssu-G₂-aroA基因已稳定整合到了玉米基因组中,并在RNA水平上得到表达。     

过量表达拟南芥GPX3基因提高玉米苗期抗旱性研究

通过农杆菌介导法将拟南芥抗旱基因AtGPX3导入玉米自交系郑58中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,在水分胁迫下对T₁代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果表明,共得到56株转化苗,检测获得9个株系的30株T₀代转基因阳性植株,抗性植株阳性率为53.6%。RT-PCR检测表明,T₁代有6个株系为稳定遗传阳性株系,并且AtGPX3基因在转基因玉米中表达量大幅度提高。耐旱性分析表明,非胁迫条件下,非转基因和转基因株系中游离脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量基本无显著差异。在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,比非转基因株系提高了46.2%;MDA含量低于非转基因玉米,比非转基因玉米下降了34%。通过导入AtGPX3基因,可以提高玉米苗期的耐旱性。     

半湿润区秸秆还田及耕作技术对土壤水分、玉米光合特性及产量的影响

研究土壤水分、玉米光合特性及产量对秸秆不同还田耕作技术的响应,为半湿润区水分、光能高效利用及玉米增产栽培模式提供理论依据。2018和2019年,采用秸秆还田和土壤耕作相结合的方法,设置秸秆离田旋耕起垄（CK）、秸秆深翻还田（SP）、免耕秸秆覆盖还田（SC）、秸秆覆盖深松（SS）4个处理。研究结果表明,2018和2019年各生育时期土壤含水率、叶面积指数、叶片的P_n、G_s、C_i和T_r,SS处理均显著高于CK处理。与CK相比,SS、SP、SC处理2018和2019年的玉米产量分别增加13.88%和14.82%、7.59%和9.12%、7.42%和8.5%。秸秆条带覆盖深松技术适合作为半湿润区水分、光能高效利用和玉米增产的一种优化栽培技术进行推广应用。     

农杆菌侵染玉米萌动胚转化抗逆基因BcBCP1

以5份优良玉米自交系为试材,采用农杆菌侵染玉米萌动胚的方法转化蓝铜蛋白类似基因BcBCP1,同时优化遗传转化体系。结果表明,菌液浓度为OD600=0.8、侵染24h、共培养3d时,遗传转化率分别达到最高;不同基因型的遗传转化率存在差异,其中丹598转化率最高,达到6.67%;丹599的遗传转化率最低,为0.56%,5个不同基因型的平均遗传转化率为2.13%。共获得PCR阳性植株43株,其中28株结实。     

农杆菌介导法将抗草甘膦基因EPSPS转入玉米自交系的研究

通过农杆菌介导法将抗草甘膦基因EPSPS转入玉米自交系H99中,同时研究了农杆菌浓度、侵染时间及共生培养条件等因素对转化频率的影响。结果表明:菌液浓度OD600为0.6、侵染时间20 min、共生培养时间3 d为最佳转化条件。获得的转基因植株经PCR分析鉴定,其中7株表现阳性,证明外源基因已经整合到玉米基因组中。     

二穗短柄草成熟胚再生体系建立及农杆菌介导转化研究

为建立二穗短柄草组织培养及遗传转化体系,以二穗短柄草BD21-3成熟胚为外植体,对成熟胚愈伤诱导、分化以及农杆菌侵染条件进行了研究。结果表明,在含有2.5mg·L~(-1) 2,4-D的培养基上,愈伤组织出愈率最高为93.83%;在含有0.2mg·L~(-1) KT的分化培养基上,分化率最高为38.18%;对二穗短柄草胚性愈伤组织农杆菌转化和GUS染色结果表明,侵染的过程中农杆菌菌液浓度OD_(600)为0.6、侵染时间为5min时转化率最高。     

玉米高效农杆菌转化体系的研究进展及其影响因素分析

转基因技术作为植物分子育种的重要手段之一,具有许多不同于传统育种技术的独特优点,受到了国内外科研工作者的高度重视。目前转基因玉米的商业化种植已经获得了巨大成功。玉米遗传转化的受体主要是幼胚或幼胚诱导的愈伤组织,由于受到基因型、生长季节、取材时间等因素制约,大大限制了转基因技术在玉米育种上的产业化应用。总结对农杆菌介导的玉米高效遗传转化体系的研究进展,对影响转化效率的关键因素进行分析,并对玉米遗传转化的产业化应用前景进行讨论和展望。     

源于玉米幼苗的幼嫩叶段愈伤诱导及其植株再生的研究

以6个不同基因型的玉米自交系幼嫩叶段为外植体,研究其愈伤诱导、继代和分化过程。结果表明,3mg/L 2,4-D是诱导叶段愈伤组织较为适宜的,玉米愈伤组织的诱导及分化与基因型有密切关系。从供试的6个基因型中筛选出出愈率较高、愈伤组织形态较好的3个基因型齐319、Mo17、鲁原92,对它们的愈伤组织进行GUS瞬时表达检测表明,来源于幼苗叶段的愈伤组织GUS+转化率较高。     

农杆菌介导甘蔗基因转化技术的优化

以甘蔗（Saccharum officinarum L.）品种ROC10为转化受体材料,以GFP基因为报告基因,通过对农杆菌介导遗传转化的一系列条件,包括农杆菌菌株及侵染菌液浓度、侵染时间、受体愈伤组织龄期、AS活化时间及使用浓度、共培养时间等进行优化,同时进行了便于vir基因活化和T-DNA转移的条件组合,如附加果糖和葡萄糖、酸性环境感染,低温共培养等,从而建立了一个可行、有效而又简便的农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系。结果表明:农杆菌菌株EHA105优于LBA4404,其适宜侵染浓度D600为1.3752;适宜受体愈伤组织龄期为25℃暗培养25d;适宜侵染时间为30min;适宜AS活化时间为2h,使用浓度为200μmol·L-1;适宜共培养时间为4d。获得2株有荧光信号的植株,对这2株植株进行斑点Southern杂交检测,均有阳性反应,证明GFP基因已整合到甘蔗基因组中并得到了有效表达,表明该转化体系确实是有效的。      

耐盐碱转基因玉米的获得及其抗性分析

依据Gen Bank数据库中发表的拟南芥DREB基因序列进行优化,人工合成DREB基因序列,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法将DREB基因转入玉米自交系Hi II中,获得转DREB基因玉米材料,经过分子检测获得4个阳性转化事件。在不同浓度水平的Na Cl溶液(40、80、120 mmol/L)和Na_2CO_3溶液(10、20、30 mmol/L)胁迫下,研究其耐盐碱性。结果表明,DREB基因已经整合到玉米基因组中,转DREB基因玉米的耐盐碱性获得显著提高,80 mmol/L的Na Cl溶液和20 mmol/L Na_2CO_3溶液可以作为转DREB基因玉米的耐盐碱分析条件。     

小麦愈伤组织再生相关基因TaTCP-1A的克隆及功能鉴定

为深入探讨小麦再生分子机制、给建立高效的小麦遗传转化受体系统奠定基础,通过电子拼接、RT-PCR及RACE等方法在小麦品种郑麦7698中分离到一个与小麦愈伤组织再生相关的候选基因TaTCP-1A。序列分析表明,该基因的cDNA序列全长为2 163bp,其中包含了一个1 623bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。qRT-PCR结果表明,该基因具有组织表达特异性,在愈伤组织中表达量最高;在愈伤组织形成阶段,随诱导时间的延长,其表达量逐渐上升,当诱导11d时表达量达到峰值,随后呈下降趋势;此外,TaTCP-1A基因在胚性愈伤组织中的表达量高于非胚性愈伤组织。基因沉默结果表明,转TaTCP-1A RNAi小麦植株的再生率比对照降低了85.09%,这一结果初步证明该基因对小麦愈伤组织再生有一定的促进作用。     

间作条件下玉米与马铃薯的养分利用特征

采用田间小区试验,通过2行玉米间作2行马铃薯、4行玉米间作4行马铃薯及相应单作试验,在玉米拔节期和大喇叭口期比较植株氮磷钾浓度和养分吸收量,研究玉米间作马铃薯中养分吸收和肥料利用效率的变化。结果表明,玉米大喇叭口期,间作玉米植株氮钾浓度显著低于单作(F_氮=6.608,P_氮=0.015;F_钾=5.148,P_钾=0.028),且根、茎、叶中氮磷钾浓度都低于单作处理,部分差异达到了显著水平,根对氮和磷的利用贡献大一些,茎对钾的利用贡献大。间作玉米的养分吸收量没有优势,但间作玉米单株产量极显著高于单作,产量与玉米大喇叭口期植株氮钾浓度极显著和显著负相关,表明提高玉米氮钾利用效率可促进增产。     

玉米COBRA基因家族分析及重要成员ZmCOBL03基因编辑

利用生物信息学的方法分析玉米COBRA家族10个成员的序列特征、与其他物种的进化关系和组织特异性表达模式。结果表明,10个COBRA家族基因都含有CCVS保守结构域,并且均定位于细胞膜上。系统进化分析结果显示,该家族可以分为2个亚族,每个亚族内的基因具有相似的基因结构和理化性质。以ZmCOBL03为候选基因开展基因编辑,采用双靶标位点的设计思路,利用农杆菌介导的玉米遗传转化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功获得ZmCOBL03基因靶向突变的玉米株系。表型分析证实,ZmCOBL03基因突变后严重影响了玉米的正常发育,表现为植株极端矮化且生殖生长受到抑制,证实ZmCOBL03基因在植物细胞壁纤维素合成中发挥重要作用。