猪制品中非洲猪瘟病毒核酸提取方法的比较

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。结果显示：猪制品模拟感染样品中,ASFV核酸在上清和沉淀中均被检出,且上清中的检出量高于沉淀;对于香肠模拟感染样品上清,3种核酸提取方法均适合,但以柱式提取方法为佳,病毒回收率高达82.8%;对于新鲜猪肉模拟感染样品上清,以磁珠吸附核酸提取方法为佳,病毒回收率为20.9%;对于血粉模拟感染样品上清,以柱式核酸提取方法为佳,病毒回收率为10.2%。本研究为不同猪制品中ASFV核酸提取提供了参考。     

非洲猪瘟病毒与猪伪狂犬病病毒双重PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）的方法,本研究根据GenBank中的ASFV 72基因和PR V UL27基因的保守序列分别设计2对特异性引物,通过对双重PCR反应条件的优化,建立快速检测ASFV和PR V的双重PCR方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。特异性试验结果显示,该方法对ASFV与PRV核酸的扩增能获得246 bp和401 bp的特异性目的片段,而对PRRSV、PEDV和CSFV的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对ASFV和PRV核酸最低检测量分别为0.01 pg和0.12 pg。结果表明：建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性较好、快速简便等特点,可用于这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID₅₀/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。     

2021—2022年南京市野猪中8种病毒感染情况及PCV2全基因组遗传进化分析

野猪是多种重要动物疫病的天然宿主,为了解2021—2022年期间南京市野猪疫病感染情况、基因型及遗传变异特征,为野猪疫病的防控提供科学依据,在江苏省南京市共采集30头野猪的76份样品,其中30份全血样品、30份血清样品、6份粪便样品和10份组织样品(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织的混合样品)用于开展猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的病毒核酸及抗体检测。不同样品PCR检测结果显示,30头野猪中有12头PCV3阳性,阳性率为40%;PCV2阳性率为6.7%;其余病原核酸检测均为阴性。在PCV2检测阳性的野猪样品中成功获得2条PCV2全基因组序列,且均属于PCV2d基因亚型。血清抗体检测结果显示,野猪PCV3、PCV2、PRV gB、PRRSV、PEDV和FMDV A型抗体阳性率分别为53%、30%、30%、3.3%、3.3%和6.7%;所有野猪CSFV、ASFV、PRV gE抗体和FMDV O型抗体检测均...     

五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

目的：研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性样品的相对提取效率,为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取,用荧光RT-PCR方法进行检测,获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值,分析五种提取方式的相对提取效率。结果对合适的提取样品,磁珠提取法相对提取效率最高,吸附柱法其次,Trizol提取法相对效率较差;在三种磁珠提取法中,提取效率相差在2个CP值内,差异不明显,但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定,效率最高;国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。     

不同类型鸡泄殖腔棉拭子禽白血病病毒p27抗原检测与病毒分离的相关性分析

为探讨泄殖腔棉拭子或种蛋中禽白血病病毒(ALV)-p27抗原检测与病毒分离检测之间的相关性,对不同类型鸡编号后分别对应采集泄殖腔棉拭子或蛋清后以ALV-p27抗原检测试剂盒检测,同时无菌采集抗凝血接种DF-1细胞进行ALV的分离鉴定。结果显示,人工感染A亚群ALV的SPF鸡群泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测与病毒分离有很高的吻合率,相对于病毒分离法,119次泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测中出现有1例假阳性和3例假阴性;从美国进口的200只祖代肉鸡3次采血DF1细胞分离病毒结果均为阴性,而泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原阳性率依次为4.00%(8/200),2.97%(5/168)和2.61%(4/153),假阳性率为3.30%。相对于病毒分离法,正在实施ALV净化的不同遗传背景地方品系鸡泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测的假阳性率高达93.20%~100.00%,还有一定比例假阴性(1/9,1/4,1/3)。本研究大量对应比较的数据表明,相对于血浆病毒分离法,不同类型鸡的泄殖腔棉拭子ALVp27抗原检测法不仅有很高的假阳性率,还有一定比例的漏检率。在种鸡场的ALV净化过程中考虑到成本,不建议以泄殖腔棉拭子作为检测材料。本试验为我国鸡群禽白血病净化检测和临床鉴别诊断提供参考依据。     

三种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒和两种核酸提取方法的比对

为评价不同荧光PCR检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测效果,以及不同核酸提取方法对ASFV的提取差异,选取ASFV B646L基因标准物质作为模板参照,通过荧光PCR检测对标准曲线、最低检出限(LOD)、特异性、检测时间等进行比较,分析3个厂家商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒(A、B、C)的综合性能;选取磁珠法和柱式法两种核酸提取方式,对标准物质核酸提取后进行ASFV荧光PCR扩增,以Ct值大小评价试剂的提取效果。结果显示：3种ASFV荧光PCR试剂盒决定系数(R²)分别为0.985、0.996、0.985,且特异性较好;3种ASFV荧光PCR试剂盒LOD介于10^-1～10^-2 copies/μL,A试剂盒反应循环数最多且反应时间最长(105 min),LOD为10^-2 copies/μL。全自动核酸提取工作站与手工核酸提取Ct值无统计学差异(P> 0.1),批内变异系数(CV)在1.5%以内。结果表明：3种荧光PCR检测试剂盒的综...     

山东省外观健康羊群中检出羊边界病病毒

2014年从山东省外观健康的牛羊采集鼻拭子样品共707份,提取其RNA,用流感病毒特异性引物进行RT-PCR检测。对RT-PCR扩增的阳性产物进行序列测定,意外发现其中1份羊拭子样品含有羊边界病病毒,并且该结果得到其他试验验证。结合我国2012年首次在安徽和江苏两地检出该病毒,以及当前我国羊群流通情况,推测该病毒可能在我国有所存在。该调研结果对分析各类RT-PCR检测的假阳性产生原因,有参考意义。并提示RT-PCR检测结果难以作为疫病或感染病诊断的确切依据。其诊断结果有时需要用荧光探针或测序进行进一步鉴定。     

非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(ASFV)检测,本研究建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法,该方法采用纳米金颗粒作为热导介子,提高了PCR反应效率,采用该方法同时检测ASFV、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、典型猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪捷申病毒、猪脑心肌炎病毒等,结果只有ASFV能够扩增出552 bp的目的片段。敏感性试验表明纳米PCR检测技术是常规PCR检测技术敏感性的1 000倍以上,最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性,在以上3个地区均未发现ASFV感染情况。     

应用非洲猪瘟病毒基因质粒标准物质评价荧光PCR试剂盒及核酸提取方法

为评价不同检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的检测性能,以及不同提取方法对ASFV核酸的提取效率,本研究以国家标准物质“ASFV B646L基因质粒标准物质”作为模拟样品,通过荧光定量PCR检测,比较扩增曲线、Ct值等指标,分析了4个厂家的5种试剂盒的敏感性、重复性及反应耗时等检测性能,同时比较了磁珠法与柱式法等2种核酸提取方法的提取效率。结果显示：5种试剂盒均能有效检测出不同浓度的ASFV B646L基因质粒标准物质,不同的试剂盒最低检测限不同,最低的试剂盒为5.8×10^-1 copies/μL,线性关系最优的试剂盒R~2=0.997,各试剂盒实际反应时间与理论时间均有差异。2种提取方法均可有效提取ASFV B646L基因质粒标准物质,其中柱式法的提取效率高于磁珠法,但柱式法的离散度大于磁珠法。综上,4个厂家的5种试剂盒及柱式法与磁珠法均可使用ASFV B646L标准物质作为基准进行试剂盒性能及提取效率评价。在实际检测中,应根据具体情况选择合适的检测试剂盒及核酸提取方法。     

基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种病毒中仅PEDV为阳性扩增结果,其余病毒为阴性结果,特异性较强;对PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10^1拷贝/μL,敏感性较高;组内、组间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法对采集的272份临床仔猪腹泻样品(粪便、小肠组织)进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品39份,阳性率为14.34%,与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%;本研究建立方法检测的阳性样品经PEDV N基因测序鉴定,确实均为PEDV阳性样品。本研究建立的基于DPO引物检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法为PEDV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。     

含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

湖南省部分屠宰场非洲猪瘟监测

为了解屠宰场非洲猪瘟病毒(ASFV)污染情况,评估其潜在传播风险,2018年10月,在湖南省86个屠宰场采集样品895份,使用荧光PCR方法进行ASFV核酸检测。结果显示,11个屠宰场的43份样品呈ASFV核酸阳性,场阳性率为12.8%,样品阳性率为4.8%。调查分析表明,ASFV阳性屠宰场与是否屠宰过来自疫点的生猪及场内环境、工具、车辆的消毒情况相关。调查提示,屠宰场应继续加大ASFV自检力度,政府和主管部门需继续加强检疫监管,以降低ASF扩散风险。     

非洲猪瘟检测样品的选择

为了选择非洲猪瘟病毒感染早期、中期和晚期3个阶段诊断的最佳样品,试验选取50头临床表现为采食量下降或不食、发烧、流产的母猪为研究对象,采集其环境样品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血等6种样品共900份,采用定量PCR方法检测非洲猪瘟病毒核酸,比较6种样品中核酸的阳性率和Ct值。结果表明,感染早期的咽拭子非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率最高为42%;中期血液中非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率为25%;后期环境样品中非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率最高为54%,血液病毒载量最高。综合现场操作,认为非洲猪瘟诊断中,不同时期选择的最佳样品分别是:感染前期采集咽拭子进行检测,中期采集尾根血进行检测,后期采集环境样品进行检测。     

湖南省猪肉及相关产品非洲猪瘟监测与分析

2018年10-12月在湖南省内652个冷库、肉品加工厂及超市等场点,对1 356个批次的产品中随机抽取4 787份猪肉及其产品,使用荧光定量PCR方法进行非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸检测。结果显示,有77份样品ASFV核酸阳性,阳性率为1.6%;阳性样品类型包括冻猪肉、肥膘、板油、冻猪肚、冻猪内脏、腊肉、香肠、水饺、冻猪舌等,至少有33份阳性样品来自外省,占总阳性数的42.9%,生产时间最早为2018年4月份;表明我省ASFV疫情的最早传播可能来自肉产品。     

猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染病例的实验室诊断

为确诊贵阳市某养猪场生猪发病死亡的原因,采集3头病猪的血液、肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结病料,采用PCR、qRT-PCR方法进行猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒核酸检测.结果:在血液及组织样品中猪圆环病毒2型核酸检测均为阳性,猪瘟病毒核酸检测均为阴性;在血液样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测结果为阴性,而...     

多重荧光PCR鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒

为了建立一种快速、灵敏、特异的能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR方法。根据GenBank中公布的猪瘟病毒基因序列,设计一套特异性的引物和探针,对猪瘟病料提取RNA,经RT—PCR扩增后将产物回收,克隆至pMDl8-T构建pMDl8-T—CSFV阳性质粒;非洲猪瘟的目的片段序列采用化学合成,构建pMDl8-T—ASFV阳性质粒。以两种阳性质粒为模板时建立的多重荧光PCR方法做特异性、灵敏度和重复性试验,结果表明该方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、猪圆环病毒2型区分开,灵敏度可以达到10拷贝的数量级．而且方法稳定。对2份已知猪瘟阳性血清样品和120份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品检测后．发现对已知阳性样品的检测结果符合预期目标。未知样品检出猪瘟病毒3份阳性,未检出非洲猪瘟病毒阳性。     

猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。     

规模养猪场仔猪病毒性腹泻病原的分子检测

为了解保山市隆阳区规模养猪场仔猪病毒性腹泻的病原感染情况,应用RT-PCR或PCR方法对采自保山市隆阳区不同地方16家养猪场腹泻仔猪的肛门拭子样品进行了5种病毒性病原的检测。结果显示阳性检出率最高的为猪圆环病毒(PCV-2),16家猪场均检出阳性样品,阳性样品率最高达到100%,最低33.33%;其次为猪流行性腹泻病毒(PEDV),16家养猪场有4家猪场检出了PEDV阳性样品,占采样养殖场数的25.00%,阳性样品率分别为25.00%、33.33%、25.00%、20.00%。但此次所采样品中未检出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)及猪瘟病毒(CSFV)3种病原,3种病原的阳性样品率都为0;检测的这93份样品中存在部分混合感染的情况。     

2021年云南省玉溪市活禽交易市场禽流感病毒监测

为了解云南省玉溪市活禽交易市场禽流感病毒污染情况,2021年对该市8个县（市、区）活禽市场进行采样检测。全年共采集63场次1 455份棉拭子样品（禽咽喉/泄殖腔双拭子860份、环境拭子317份、运输工具拭子278份）,采用荧光RT-PCR方法进行流感病毒A型、H5/H7/H9亚型流感病毒核酸检测。共检出A型流感病毒核酸阳性435份,未检测到H5和H7亚型病毒核酸阳性;除检出7份未分型阳性样品外,在44场次检出H9亚型病毒核酸阳性428份,场次阳性率为69.84%,样品阳性率为29.42%,其中活禽、环境、运输工具样品阳性率分别为32.56%、25.87%、23.74%,差异具有统计学意义（P <0.05）。一年四季均能检测到H9亚型病毒阳性,但3—6月份样品阳性率低于年均阳性率,1、2、7、10、12月样品阳性率明显高于其他月份,各月份间样品阳性率差异具有统计学意义（P <0.01）。各县（市、区）的场次阳性率存在差异（P <0.05）,但样品阳性率差异无统计学意义（P> 0.05）。结果表明：玉溪市活禽市场H5、H7亚型高致病性禽流感病毒的污染状况得到有效控制...