EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

油用亚麻机械化栽培技术

油用亚麻是古老的栽培作物,利用其榨油也有100多年的历史,但由于人们对于油用亚麻中的多烯不饱和脂肪酸缺乏正确的认识,对其易发生酸败也无方解决,因此对油用亚麻的研究一度搁潜.近20年来,国内外科学家研究表明,油用亚麻在保健品的深加工和开发上,有着广阔的市场和前景.     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79 EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体（Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS）将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。     

油用亚麻染色体核型分析

采用压片法对两个油用亚麻品种进行染色体核型分析研究.结果表明,两个油用亚麻都为二倍体,其中红胡麻有16对染色体,其核型公式为2n =2x =32=16m+ 16T,核型类型为“2B”,染色体臂指数NF值=48,核不对称系数As·K=70.56％;张亚2号有15对染色体,其核型公式为2n=2x=30=24m+ 6sm,核型类型为“2B”,染色体臂指数NF值=60,核不对称系数As·K=56.33％.     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

河北省油用亚麻当前育种任务及对策

对河北省油用亚麻育种历程进行了回顾,针对油用亚麻生产上七个方面急需解决的问题,对油用亚麻育种工作提出了新要求.从加强育种方法研究与拓宽育种途径、加强骨干亲本材料的培育、加强育种遗传规律的理论研究、育种单位高代材料穿梭育种、挖掘整理国内外品种资源建立资源库等五个方面探讨了应对措施.     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

激发子隐地蛋白(cryptogein)基因的克隆及其植物表达载体的构建

从隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)中克隆cryptogein蛋白激发子基因,经测序证实后.针对病原菌侵染和cryptogein基因本身的特点,选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型、并受病原菌诱导的水稻苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的启动子;同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外,更好地与植物细胞膜受体互作,在cryptogein基因前还融合了烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽.然后将此融合基因克隆到植物表达载体CHF3中,获得植物双元表达载体CHF3-PAL-PR1b-Cry,再将此载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中.     

DDF2基因克隆及植物表达载体构建

采用CTAB法提取拟南芥叶片总DNA,根据已报道的DDF2基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到1条约550 bp的特异片段,把该片段连接到pGEM-T Easy Vector.上进行测序,结果表明:该基因编码区全长546 bp,为开放阅读框,共编码氨基酸181个,与报道序列完全一致.并构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-DDF2,采用冻融法将其转入根癌农杆菌,为后期该基因遗传转化花卉,改良花卉品质,并提高其抗逆性打下了一定的基础.     

番茄LeABI3基因的克隆与植物过量表达载体的构建

从番茄成熟种子中提取总RNA,反转录得到cDNA.根据GenBank中番茄LeABI3基因序列设计引物,通过PCR方法获得了番茄LeABI3基因的2个转录本,其中转录本1序列比GenBank中LeABI3基因编码区序列多出30 bp,含1个1 740 bp的开放阅读框,编码579个氨基酸;转录本2比GenBank中LeABI3基因编码区序列也多出30 bp,同时在编码区内另一个位置因剪接而缺失了122 bp的核苷酸序列.通过替换掉植物过量表达载体PBI121上的GUS编码区序列,将序列无缺失的转录本1连接到PBI121上,对所获得的重组质粒进行双酶切,结果表明植物过量表达载体PBI121-LeABI3构建成功.     

OsWRKY79基因克隆和植物表达载体的构建

WRKY是植物体中重要的转录因子,克隆水稻Os WRKY79基因将为其在植物体内的定位和功能研究奠定基础.根据GenBank公布的Os WRK Y79基因序列设计特异引物,以RT-PCR法从水稻幼苗中克隆OsWRKY79基因,将其亚克隆至含有GFP基冈的pBinGFP表达载体中,经菌落PCR和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pBinGFP-Os WRKY79.     

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

[目的]克隆木薯葡聚糖水合双激酶(MeGWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯MeGWD3基因调控及功能研究提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆MeGWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的pCAMBIA2300载体,构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结果]MeGWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸.经序列比对,发现MeGWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM 002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结论]成功构建的植物表达载体pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究.     

人肝再生增强因子基因的克隆和真核表达载体的构建

从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目的片段亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切方法鉴定重组子。采用RT-PCR技术成功地获得了hALR基因片段。序列分析表明,克隆的hALR基因与Genbank报道的人ALR核苷酸序列基本一致。完成了真核表达载体的构建,为hALR基因的真核表达奠定了基础。