菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

菠萝凋萎相关病毒（Pineapple mealybug wilt associated virus-2,PMWaV-2）是引起的菠萝凋萎病（Mealybug wilt of pineapple,MWP）的重要病原。本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品,对阴性样品及空白对照均无荧光反应;灵敏度比普通PCR高100倍;重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内,表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。     

主要果树病毒实时荧光定量PCR检测技术研究进展

综述了苹果、梨、柑橘、葡萄和香蕉病毒的实时荧光定量PCR检测技术研究进展,并对今后主要研究方向进行了讨论和展望。     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweet potato latent virus-lotus,SPLV-lotus)在江苏省莲藕产区普遍引起发病,并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况,针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R,通过优化引物浓度和退火温度条件,构建标准曲线,建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测技术。该方法特异性强,可以快速检测出SPLV-lotus,灵敏度为普通PCR的100倍,可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。     

香蕉束顶病毒实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）复制酶基因保守序列设计特异性探针及引物,建立了BBTV实时荧光PCR（TaqMan real-time PCR）检测方法。结果显示,所建立的检测方法在检测质粒DNA标准品和发病香蕉植株总DNA时,其灵敏度均比普通PCR高,且与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）无交叉反应。同浓度样品进行7次重复性试验,各重复扩增结果所得Ct值的变异系数为0.93%,表明建立的荧光定量PCR检测方法重复性好,Ct值保持稳定。利用所建立的方法检测带毒香蕉吸芽繁殖的组培苗中的BBTV,发现BBTV含量随着继代数的增加而增加,并且组培苗顶部叶片中的含量高于其他部位的叶片。     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

实时荧光定量PCR 检测蔬菜病原细菌技术

植物病原菌的实时荧光定量PCR 检测方法为病原菌的研究和病害的防治提供了新的思路。本文对实时荧光定量PCR 技术的原理,近年来检测蔬菜病原细菌方法的特异性、灵敏性及应用和发展前景等方面进行了评述,为蔬菜病原细菌的研究和病害的防治提供理论基础和技术支撑。     

马铃薯Y病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,相关系数R²为0.9912,可特异性检测PVY,灵敏度达常规RT-PCR的1000倍,重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5个地区马铃薯植株中的PVY进行检测,检出率较常规RT-PCR技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00百分点。因此,建立的PVY实时荧光定量RT-PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株中PVY的含量,为马铃薯Y病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。     

苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立苹果锈果类病毒(ASSVd)检测灵敏的方法。【方法】根据Gen Bank中ASSVd的RNA序列设计特异性引物ASSVd-F和ASSVd-R,利用实时荧光PCR方法对其进行检测,并对体系的特异性、灵敏性及适用性进行验证。【结果】实时荧光PCR体系能检测至1×10-6的模板浓度,而常规RT-PCR只能检测至1×10-4,由此可知,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR 100倍;引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)均不能检出;适用性广,可检测出植物不同部位的ASSVd。【结论】所建立的方法能够灵敏检测ASSVd,特异性强,适用性广。     

马铃薯Y 病毒实时荧光定量RT-PCR 检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank 已登录序列设计引物建立了马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）实时荧光定量RT-PCR 检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数R² 为0.991 2，可特异性检测PVY，灵 敏度达常规RT-PCR 的1 000 倍，重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5 个地区 马铃薯植株中的PVY 进行检测，检出率较常规RT-PCR 技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00 百分点。因此，建 立的PVY 实时荧光定量RT-PCR 检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株 中PVY 的含量，为马铃薯Y 病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。     

葡萄蚕豆萎蔫病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及应用

建立了葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系(扩增效率103.8%,相关系数0.998),灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍,并具有特异性。采用RT-qPCR和常规RT-PCR方法对葡萄不同发育时期及不同部位的316个样品进行检测,结果表明RT-qPCR方法对GFabV的检出率(96.8%)明显高于RT-PCR(70.8%)。RT-qPCR对休眠枝条中GFabV的检出率达100%,对其他部位样品的检出率均在92%以上,明显高于RT-PCR(42%～97%)。各个发育时期样品GFabV的RT-qPCR检出率(85%～95%)也普遍高于RT-PCR(70%～90%)。该技术对于田间样品的检测适用范围广。     

太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重RT-PCR检测

针对不同产地栽培的太子参(Pseudostellaria heterophylla)中主要存在芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)和蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染且为害严重的情况,建立能同时检测这2种病毒的双重RT-PCR快速检测方法。根据Gen Bank数据库中的Tu MV、BBWV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列的保守区域分别设计简并引物,在单一RT-PCR检测体系的基础上,建立和优化双重RT-PCR检测体系。双重RT-PCR的优化结果显示,最佳扩增循环数为35,最佳引物浓度为0.4μmol·L~(-1),最佳退火温度为51℃。其灵敏度测定结果显示,2种病毒在样品c DNA稀释至原液的10-4倍后仍能扩增出特异条带。应用该方法对7份栽培太子参样品和4份脱毒苗样品进行了检测,结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测Tu MV和BBWV。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

 葡萄卷叶伴随3型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3）和葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白（coat protein,CP）基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing,VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。     

柑桔裂皮类病毒RT-PCR检测体系的建立及优化

柑桔裂皮类病毒(CEVd)是严重危害柑桔生产的一种世界性病害.本研究以感染CEVd的柑桔叶片为材料,提取总RNA,采用RT-PCR进行检测,并对PCR反应体系进行优化.结果表明:rTaqDNA聚合酶和Hotstart TaqDNA聚合酶能有效排除非特异性带的干扰;使用PCR增强剂,能有效解决CEVd非特异性带的干扰,提高了PCR的扩增效率.     

DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究

在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)3种方法检测卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)的比较。结果表明:DAS-ELISA的检出率明显低于RT-PCR和IC-RT-PCR方法。RT-PCR可以检测出RNA提取液为1:10-4的GLRaV-3病毒,但它受到了提取RNA难以及其它物质(如蛋白质、DNA等)干扰的影响,检测难度增加。从检测的灵敏度来看,RT-PCR和IC-RT-PCR比DAS-ELISA灵敏;并且,IC-RT-PCR比其它两种方法较快,整个过程仅需8h。     

蓝莓休克病毒的RT-PCR快速检测方法建立

以蓝莓叶片为试材,提取病毒RNA,根据已报道的蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)外壳蛋白基因序列设计特异性引物,建立RT-PCR快速检测方法,并对采集的20份疑似病例进行检测。结果表明:建立的RT-PCR方法具有良好的特异性和较高的灵敏度。仅从感染BlShV的样品中扩增出与预期大小相符的特异性目的片段,而从其它蓝莓病毒及健康样品中未扩增到目的片段;该方法能检测到RNA原液的10-4倍稀释液,灵敏度较高。疑似病例检测结果与ELISA验证结果完全相符。试验表明,建立的RT-PCR方法能够用于BlShV的现地检测。     

百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp（LMoV）、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。