家蚕泛素结合酶新基因的克隆与基因组结构及5′调控区分析

在家蚕丝腺cDNA文库测序过程中,发现一个编码家蚕泛素结合酶的EST序列,利用3′RACE方法克隆了一个新的家蚕泛素结合酶基因cDNA全长序列,命名为BmUCE2 I(GenBank登录号为DQ219874)。家蚕BmUCE2 I基因全长cDNA由465 bp的开放阅读框序列(ORF)、97 bp的5′端非翻译区序列(5-′UTR)和237 bp的3′端非编码区序列(3-′UTR)组成,其编码的154个氨基酸与其他真核生物间具有较高的同源性。利用BmUCE2 I的EST片断作探针,通过筛选家蚕噬菌体基因组文库,获得了家蚕BmUCE2 I基因组序列和5′调控序列。BmUCE2 I基因由4个外显子和3个内含子组成,在5′端上游调控区域没有类似TATA盒元件,但在-219~-268 bp的区域存在一个50bp的启动子序列,此外还存在CF2-Ⅱ、FTZ、DFD、BRCZ2、DL、STAT、PRD-HD等多个转录因子结合位点。家蚕泛素结合酶新基因的克隆、基因结构及5′调控区的分析为进一步研究泛素蛋白水解酶复合通路相关基因的调控规律提供了重要依据。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

牛锌指蛋白312基因的克隆及序列分析

本试验采用RT-PCR和测序相结合的方法克隆了牛锌指蛋白312(ZnF312)基因,得到了1812 bp的cDNA序列,包括63 bp的5'非翻译区(1-63)、1377 bp的CDS区(64-1440)和372 bp的3'非翻译区(1441-1812)。采用生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的结构和功能,结果表明,ZnF312基因位于22号染色体上,编码458个氨基酸,分子质量为48.82 ku,等电点为9.419,含有6个锌指结构域(ZnF_C2H2),与人、黑猩猩、小鼠、大鼠和狗的ZnF312蛋白序列的相似性分别为97%、97%、94%、94%和95%,ZnF312蛋白亚细胞定位于细胞核的概率为95.7%,定位于线粒体的概率为4.3%。结合ZnF_C2H2在真核生物中的重要作用,推测牛ZnF312蛋白可能识别相应的靶基因,在生长发育或疾病控制中起着重要的作用。     

内蒙古绒山羊 CDK2 基因的克隆与序列分析

采用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,首次从内蒙古绒山羊睾丸组织中克隆出羊CDK2基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EF035041）。结果显示：羊CDK2基因的cDNA序列长为1355bp,5′端非翻译区为174bp,3′端非翻译区为266bp,开放阅读框为894bp,编码298个氨基酸。与牛CDK2基因cDNA序列同源性为98％,氨基酸序列完全一致;和其他哺乳动物CDK2基因的cDNA序列同源性也达92％以上;氨基酸序列同源性为93％以上。说明CDK2在结构和功能上有很高的保守性。     

野桑蚕肌球蛋白轻链2基因(MLC2)的克隆和序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了野桑蚕间接飞行肌(in-direct flight muscle,IFM)的肌球蛋白轻链2(myosin light chain2,MLC2)基因(GenBank登录号:EU332913),其cDNA序列全长979 bp,包括63 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)、603 bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA和310bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR)。克隆该基因的内含子序列并分析基因结构表明,该基因包括3个外显子和2个内含子,编码201个氨基酸,预测蛋白质分子质量约22.0 kD,等电点4.67。用在线软件SMART分析显示,野桑蚕MLC2蛋白有2个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+,属于肌钙蛋白C超家族成员,并且含有保守的可以磷酸化的氨基酸残基,有可能具有磷酸化过程,参与肌动球蛋白ATPase活性的调节。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

鹅FSHβ基因克隆及序列分析

促卵泡激素β亚基(FSHβ)基因是动物繁殖性状的一个重要候选基因,对鹅产蛋量具有重要的调节作用。本研究以鹅垂体组织总RNA反转录的cDNA为模板,分别采用RT-PCR和RACE技术扩增鹅FSHβcDNA序列,包含:16 bp 5′UTR,396 bp开放阅读框(ORF)和3′端非翻译区2个不同的剪接体,其大小分别为518 bp和780 bp。经生物信息学软件分析,发现鹅FSHβ基因编码的蛋白为亲水蛋白,且存在信号肽序列切割位点,则推测其为分泌蛋白。本研究首次成功获得了鹅FSHβ基因的cDNA全长序列并进行了分析,可为全面解析鹅FSHβ基因的分子结构及功能提供一定的参考。     

牛ACAS2基因的电子克隆与序列分析

本研究以牛的乙酰辅酶A合成酶2(ACAS2)基因为研究对象,利用生物信息学方法和同源序列克隆技术,对牛的ACAS2基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ACAS2蛋白结构与性质进行了初步分析。实验结果:牛ACAS2基因的cDNA序列长2 726 bp,包括了2106 bp的开放阅读框序列(ORF),54 bp的5?非翻译区序列(5?UTR)和566 bp的3?非翻译区序列(3′UTR),由702个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与人,猕猴,小鼠,黑猩猩,家犬ACAS2基因的相似性分别为91%,90%,87%,89%,90%,90%,推导的氨基酸序列与人,猕猴,小鼠,黑猩猩,家犬的相似性分别为94%,94%,92%,94%,87%。以ACAS2基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的ACAS2基因在人,猕猴,小鼠,黑猩猩,家犬等物种中,与家犬的亲缘关系特别近。牛的ACAS2蛋白的三级结构包含7个跨膜结构—Cutoff模体,三个比较大的分别位于169~199位氨基酸,170-191位氨基酸和326-345位氨基酸处。     

结缕草肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,提取结缕草叶片的总RNA,进行RT-PCR。并采用RACE技术扩增出1560bp的Actin基因全长cDNA序列。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1134bp,编码377个氨基酸,5′非编码区117bp,3′非编码区309bp。所得序列与GenBank中收录的其他植物肌动蛋白核苷酸序列的一致性均在85%以上,氨基酸序列的一致性高达97%以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示,结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基因的基因组DNA序列(登录号GU290546),它由4个外显子和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基因家族的进化历史,为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础,同时也为开展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供参考。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因FaSAMDC的克隆与差异表达分析

在进行高羊茅光敏色素C基因5′端克隆时,筛选到腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的5′端序列,根据5′端序列设计引物,扩增出该基因的3′端,拼接得到高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因全序列,命名为FaSAMDC(GenBank登录号:HQ606139),利用实时荧光定量PCR技术研究FaSAMDC基因在长日照与短日照条件下昼夜24 h的表达差异,为进一步揭示不同光周期调控FaSAMDC基因的表达奠定理论基础。FaSAMDC的cDNA全长1 964 bp,具有微型上游阅读框、小型上游阅读框和主阅读框3个开放阅读框,分别位于226～234,234～380和555～1 742 bp,微型上游阅读框和小型上游阅读框存在1个碱基重叠,主阅读框编码395个氨基酸,含有保守功能域:酶原剪切位点功能域和SAMDC蛋白快速降解有关的PEST功能域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,FaSAMDC与其他单子叶植物SAMDC蛋白的亲缘关系较近。在长日照和短日照处理条件下,FaSAMDC都具有3个表达峰。短日照处理条件下的表达峰比长日照处理条件下的表达峰早几个小时,但峰高低于长日照条件。由此说明,FaSAMDC基因的表达受光周期调控,与生物钟控制的昼夜节律有关。     

Expressed sequence identification and characterization of the cDNA for interleukin-4 from the mitogen-stimulated lymphoid tissue of a marsupial, Macropus eugenii

Very few cytokines that are important to the understanding of T helper cell function are characterized in marsupials. Expression of a 645 bp cDNA product that codes for a predicted Interleukin-4 peptide of 157 amino acids was detected in the lymph node tissues of Macropus eugenii, the tammar wallaby. Using Rapid Amplification of cDNA Ends, both 5'- and 3'-untranslated regions were identified and a polyadenylation signal and three mRNA instability motifs associated with secreted cytokine molecules were also present. The translated cDNA sequence has a putative signal peptide of 24 amino acids, a predicted secondary structure that is consistent with the short-chain alpha-helical cytokine family and 82% conservation of residues associated with the Interleukin-4 family sequence motif. Comparisons of wallaby nucleotide and predicted peptide sequences with the coding domains of other vertebrate species demonstrate the diversity within this gene family; with nucleotide and amino acid identities of 74% and 59% with opossum, 52% and 32% with human and 38% and 19% with chicken homologues respectively. Despite these differences in sequence conservation, the putative Macropus eugenii Interleukin-4 mature peptide contains conserved structural motifs and predicted receptor-binding residues that suggest that it may retain functional properties associated with this important Th2 cytokine in other mammals.     

TGEV的sM、M和N基因克隆及特征分析

参照(3enBank中收录的TGEV sM、M和N基因序列各设计1对特异引物，经RT-PCR扩增获得了TS株的相应基因片段，分别约为346、932和1217bp，其大小与预计的目的片段相符。与其他毒株的相应基因相比较，并经剪接后，TS株的sM、M和N基因全长分别为248、789和1149bp，各编码82个、262个和382个氨基酸；TS株与Purdue株、TF1株和96-1933株的sM基因核苷酸序列同源性分别为95．2％、92．7％和90．2％；推导氨基酸的同源性分别为95．9％、97．2％、98．8％；与Purdue株、TFl株、TGEVH株和96-1933株的M基因核苷酸序列同源性分别为95．2％、98．0％、99．6％和95．0％；推导氨基酸的同源性分别为97．0％、97．3％、98．5％、93．5％；与Purdue株、TF1株、FS722／70株、Korea株、TO14株、TC；EVH株和96-1933株的N基因核苷酸序列同源性分别为98．1％、97．7％、99．0％、98．3％、99．2％、99．0％和95．9％，推导氨基酸的同源性分别为97．9％、98．4％、99．0％、97．7％、99．5％、96．2％、96．6％。并对TS株基因间的保守序列和sM、M和N基因及其编码的相应氨基酸的结构特征进行了分析，发现sM和N基因在TGEV中保守；并提示在我国不仅存在有2个不同亚基因型的TGEV，而且我国的TGEV可能是输入性的。     

鸡传染性支气管炎病毒KIBVXJ株S1基因的克隆及序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒S1基因,设计并合成了一对引物,经RT-PCR扩增后获得全长约为1700bp的核苷酸序列。序列分析表明,S1基因的最大开放阅读框位于12位～1685位碱基之间,编码557个氨基酸;KIBVXJ株S1基因序列在19位～292位点的氨基酸区域内有较多的氨基酸置换、插入和与缺失现象;S1的裂解位点的序列为HRRRR,具有我国地方流行株的特征。KIBVXJ株的S1基因与国内外疫苗株的同源性分析表明,核苷酸同源率为73.8%～74.2%,氨基酸同源率为74.9%～76.0%。遗传进化分析表明,KIBVXJ株与国内外的主要疫苗株亲缘关系最远,与国内近年来分离的A2株、LX4株和QXIBV株的亲缘关系最近。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ZY株TfbA基因的克隆及序列分析

对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumon iae,App)生物I型ZY(App-1)株TfbA基因进行克隆和序列测定,结果表明:ZY株TfbA基因全长1 782 bp,编码594个氨基酸残基组成的多肽;对App ZY株与AP37(App-1)株、AP213(App-5)株和AP205(App-7)株的TfbA基因进行分析比较,结果表明三型TfbA的核苷酸的同源性分别为99.8%、74.4%和72.2%;氨基酸的同源性分别为99.7%、64.1%和58.6%。系统发育进化树分析结果表明,ZY株与AP37株的亲缘关系最近。分析组成TfbA蛋白N-端重叠的16聚体多肽发现了3个有转铁蛋白结合活性的区域,长度为13或14个氨基酸。第1和第3个区域在App-1、App-5、App-7型间变异较大,同源性很低,第2个区域在App-1型和App-5型两者之间同源性高,几乎相同。