伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

伪狂犬病病毒鄂A株gG^—／LacZ^＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphI/KpnI片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待细胞完全病变后，在X－gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG^-/LacZ^ 的重组伪狂犬病病毒。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明，该基因缺失疫苗10^5.0TCID50和10^6.0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的，并可保护妊娠母猪抵抗10^7.1 TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后，gE鉴刖ELISA试验表明，PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以10^5.0 TCID50和10^6.0 TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物，结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象，说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。     

伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的家畜及野生动物的急性传染病,其特征为发热、奇痒及脑脊髓炎。本病广泛分布于世界各国。近年来,猪、牛及绵羊发生本病逐年增加,我国不少省区也有本病发生,尤其是猪的发病有扩大蔓延趋势。 许多西方发达国家早在20世纪80年代就制定和启动了猪伪狂犬病的根除计划,并通过广泛使用基因缺     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。     

猪伪狂犬病活疫苗(HB-98株)的分子特性与免疫效果分析

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是危害全球养猪业最严重的急性传染病之一。猪伪狂犬病的临床症状主要表现在:(1)母猪流产、产死胎、木乃伊胎;(2)公猪感染睾丸肿胀、萎缩,失去种用能力;(3)新生     

伪狂犬病病毒鄂A株gG－／LacZ＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphⅠ／KpnⅠ片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ，将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待细胞完全病变后，在X-gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG     

猪伪狂犬病变异株及其疫苗的研究进展

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引发的高致死率的一种急性传染病。PRV变异株的出现使得PR在全国范围内广泛流传,其发病特征和致病性也变得十分严重,并且现有疫苗起不到完全的保护作用。本文对PRV变异株的致病性、分子特征和分子基础及PRV变异株疫苗研制等方面的研究进展进行了综述,以期为PRV的防控和净化提供新思路。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定

合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。     

川株伪狂犬病疫苗的动物免疫试验

本试验采用川株伪狂犬病毒,通过鸡胚原代细胞培养,48～72h收毒,以白油为乳化剂,用胶体磨乳化制苗。用该苗106.0TCID50、104.0TCID50两个剂量先后建立非靶动物(兔63只、小白鼠、大白鼠各30只、豚鼠6只)的动物模型试验及靶动物(哺乳仔猪、母猪、育肥猪共135头)的兔疫区域性试验,结果表明:本疫苗安全性良好,免疫抗体在35～45d出现高峰,免疫后猪体能抵御强毒攻击,无任何不良反应。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了2个利用人类巨细胞病毒（HCMV）的启动子启动表达伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的真核表达质粒pCIDI和pcDDI，体外转染BHK－21细胞，用间接免疫荧光法检测，证实糖蛋白gD在细胞中得到表达。用表达质粒pCIDI和pcDDI作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体，结果其滴度为1：128－1：1512。初步证实，用gD基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答反应。     

伪狂犬病病毒3基因缺失株(SA215)的遗传稳定性研究

测定了伪狂犬病病毒Fa株3基因缺失株(SA215)在鸡胚成纤维细胞上连续传代15代次,在非免疫仔猪体内连续传代5代次后,病毒毒价及对易感动物的安全性变化。并以核酸杂交、核酸酶切和gE-ELISA检测技术分别研究了缺失株(SA215)传代后不同代次病毒的外源插入基因(LacZ)、缺失基因(TK、gE、gI)遗传变异情况。结果表明缺失株(SA215)毒价及对易感动物安全性未发生变化,外源插入基因得到稳定遗传,缺失基因未见回复突变,证明缺失株(SA215)具有良好遗传稳定性。     

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)株的构建及生物学特性研究

采用磷酸钙转染系统，将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA215株DNA与PP63LacZE2 DNA共转染Vero细胞，获得SA215（A）1、SA215（A）2和SA215（A）3等12个重组病毒株。以光生物素标记的HCV E2基因为探针进行初步鉴定后，挑选SA215（A）1株作BamHI酶切和southern转印杂交鉴定，结果表明构建是成功的，将其命名为SA215（A）。直接荧光抗体检测、SDS-PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCV E2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约51 ku的囊膜糖蛋白。对SA215（A）株进行部分生物学特性研究，培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK21和鸡胚成纤维细胞等多种细胞，但对不同细胞系表现有一定的差异。SA215（A）株10^5 PFU／mL接种21日龄健康仔猪（伪狂犬病和猪瘟检测阴性），接种后28d用10^6 PFU的PRV Fa强毒株滴鼻攻毒，42d用猪瘟SM株血毒1mL（10^5 MLD／mL）肌肉注射攻击，结果表明接种猪能抵御2次病毒攻击，表明SA215（A）株具有良好免疫原性，是一株优秀的猪瘟、伪狂犬病二价疫苗候选株。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRV gD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数（R²）分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

猪伪狂犬病病毒天津变异株R13139对猪的致病性研究

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异株R13139株对猪的致病性情况,本试验将PRV R13139株和PRV经典强毒株SC株均以10⁶ TCID₅₀剂量经滴鼻途径接种6和9周龄健康仔猪各3头,空白对照组鼻腔接种生理盐水,通过攻毒后两个年龄段猪的临床症状表现、眼观病例变化、显微病理变化、抗体产生情况及病毒在体内部分情况评定两毒株对猪的致病力差异。结果显示,SC株对6和9周龄猪的致死率分别为66.7%（2/3）和100.0%（3/3）,而R13139株对6和9周龄猪的致死率分别为33.3%（1/3）和66.7%（2/3）,表明R13139株对猪的致死性弱于SC株,但R13139株引起两个年龄段猪发病时间比SC株早,同时间段的体温升高幅度更高,神经发症状更严重;眼观病理变化发现,R13139株引起的发病猪肝脏坏死现象比SC株更明显,而心脏、肺脏、脾脏、膀胱和脑的病理变化差异不明显;显微病理结果显示,R13139株对病猪的扁桃体、肺脏、肝脏和三叉神经节等组织造成的病理损伤明显强于SC株;PCR结果显示,R13139株在濒死猪扁桃体、脾脏、肺脏、三叉神经节和淋巴节（腹股沟、肠系膜和颌下）等组织脏器中分布比SC株更广泛;应用ELISA检测攻毒猪抗体发现,R13139株诱导PRV-gB抗体产生的时间比SC株早1 d。本研究结果可为揭示中国伪狂犬病重新流行的原因及进一步开展防控技术研究提供科学依据。     

逆转录病毒介导的PrV Ea株gD基因转基因细胞系的建立

采用逆转录病毒介导的方法,将PrV Ea株gD基因整合进PK-15细胞染色体中,建立起表达gD蛋白的细胞系PK^D。通过荧光观察,发现PK^D表达的gD分布在细胞膜上,具备原有的免疫反应性;同时,还发现gD蛋白在PK^D细胞膜上呈明显极性分布。PCR技术和间接免疫荧光染色法对PK^D进行检测的结果表明该细胞系具有良好的遗传稳定性。在相同培养条件下,PK^D细胞的生长速度及形态与正常PK-15细胞无明显差异。用脂质体介导的方法,将PrV Ea株基因组转染PK^D细胞,在转染后30h细胞发生典型病变,表明PK^D细胞对脂质体的毒害具有耐受性。TCID50测定结果显示：PK^D对PrV Ea株增殖尽管有明显的抑制作用,但PrV Ea株仍能在其上正常增殖。上述研究结果提示：所构建的细胞系PK^D可用于构建PrV Ea株gD基因缺失毒株,为PrV Ea株gD基因缺失毒株的构建提供了必备的工具。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料（脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏）进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞（Vero）,进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID₅₀测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID₅₀为10^-7.5/0.1 mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究

采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料,经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒感染,用BHK-21细胞进行病毒的分离培养,结果显示该病毒能引起典型的细胞病变,第4代病毒液毒价达10^7.0 TCID_50/mL;PCR和动物回归试验结果表明该分离株为PRV,并将其命名为PRV ZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗,免疫2 kg左右家兔,免疫后28 d采血并攻毒,测定其免疫原性,结果显示血清中和指数为13490,保护率为100%。本试验结果表明PRV ZJ株有很好的免疫原性,为进一步开展疫苗研究奠定基础。