敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

DKK2基因质粒的构建及其在敖汉细毛羊成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在探究DKK2基因过表达后在敖汉细毛羊成纤维细胞中的表达量变化.采集40日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织作为实验样品,首先参照GenBank中绵羊的DKK2基因序列信息进行引物设计,通过PCR反应对DKK2基因进行扩增,并与pGM-T载体进行连接反应,构建了pGM-T-DKK2重组质粒;将克隆载体转化DH5α大肠杆菌...     

质粒载体表达抑制猪瘟病毒shRNA在猪胚胎成纤维细胞上的复制

以质粒pSilencer3.1Hygro为基础,构建了针对猪瘟病毒Npro基因和NS4A基因mRNA的siRNA双表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞后,在潮霉素B的筛选压力下,获得5株稳定整合shRNA表达盒的猪胚胎成纤维细胞克隆.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72 h后对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的5株细胞克隆中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖明显降低,表明所构建siRNA双表达载体转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.本试验为研究猪瘟病毒的防治和通过RNAi建立猪的抗病育种提供了新的方法.     

绿色荧光蛋白在鸡胚成纤维细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pEGFP-C1转染到培养至第二代的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,同时使用活体DNA染料Hoechst3334(2H342)对CEF细胞核荧光染色,通过荧光倒置显微镜和RT-PCR方法检测GFP的表达产物。在荧光倒置显微镜下可见CEF的胞质和核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质,在H342作用下,细胞核呈现蓝色荧光;转染细胞中转录产物经RT-PCR扩增后,在凝胶上可见与GFP基因片段分子量大小一致的条带。可见,GFP基因可以被转染至CEF中,并在CEF中表达。     

牛Nanog基因克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

本研究克隆了牛Nanog基因,构建其真核表达载体,并转染皮肤成纤维细胞,获得能够用作核移植供核细胞的稳定转染细胞株。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT—PCR扩增Nanog基因,将其克隆到pMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pCDNA3-FLAG表达载体上,挑选序列正确的真核表达质粒pCDNA3-Nanog转染牛皮肤成纤维细胞,获得了稳定转染的细胞株。用RT—PCR和Western Blotting分别检测NanogmRNA和FLAG-Nanog融合蛋白的表达,用免疫染色法验证该细胞株是否具有干细胞特征。结果表明：（1）从胎牛原始生殖嵴中克隆了序列正确的Nanog全长编码序列;（2）所构建的pFLAG-NanDg重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中高效表达;（3）所获稳定转染的细胞株能表达Es细胞表面抗原SSEA-4和多能性维持因子Nanog、Oce-4,表明其具有一定的多能性。为进一步研究Nanog基因功能,尤其是探讨它在家畜早期胚胎发育、生产转基因动物,以及胚胎干细胞建系中的作用奠定了基础。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白基因真核表达质粒的构建及其在鸡胚成纤维细胞中的表达

通过PCR方法自含鸡白细胞介素18（Chicken interleukin-18，ChlL-18）成熟蛋白（mature ChIL-18，mChIL18）基因的克隆质粒中扩增mChlL-18基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中。阳性克隆鉴定后，在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过问接免疫荧光试验（IFA）检测到了mChIL-18在CEF中的表达。     

羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价

为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免疫小鼠的体液和细胞免疫反应。结果表明,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IL-2水平均显著高于pVAX1-B2L免疫组,与pVAX1和PBS对照组相比差异极显著(p0.01)。而且pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L免疫组、空载体pVAX1组和PBS对照组(p0.01)。因此,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫KM小鼠可以诱导特异性体液免疫和细胞免疫,并且IL-2具有免疫佐剂的作用,为进一步将其用于Orf的防制奠定了基础。     

敖汉细毛羊Noggin基因质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本实验旨在构建敖汉细毛羊Noggin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Noggin基因mRNA及蛋白表达量的变化。实验以40日龄胎羊为研究对象,采集组织样品,通过PCR反应扩增目的基因片段,经切胶回收后连接到pEM-T1载体,构建pEM-T1-Noggin后转染到大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取pEM-T1-Noggin后进行酶切鉴定。鉴定后符合标准即可构建pcDNA3.1-Noggin重组表达载体,转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养,将重组质粒pcDNA3.1-Noggin转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Noggin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-Noggin表达载体构建成功,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染组的mRNA及蛋白表达量均极显著高于对照组。本研究在细胞水平上验证了Noggin基因功能,为进一步在个体水平上研究Noggin基因功能奠定基础。     

肝特异性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的建立

试验旨在建立肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞系,为获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。通过PCR方法分别从血液和pcDNA3.1(+)载体上扩增肝脏特异性启动子α1-抗胰蛋白酶启动子(PhAAT)和BGHpolyA片段。通过双酶切(XhoⅠ、SalⅠ)从载体pGC-FRT2neo上获得FRT2neo交换盒,再利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,最后通过三重融合PCR方法和酶切方法将4个片段连接。利用真核表达载体pC1-neo构建出Cre表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo。Lipofectamine^TM2000介导转染猪成纤维细胞,通过G418筛选出阳性细胞系,最后通过PCR鉴定证明构建的Cre重组酶表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo成功整合到细胞的基因组中,获得了肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。     

Distribution and Expression of Recombinant Plasmid Encoding Chicken Interleukin-2

A plasmid DNA that encodes chicken interleukin-2 (pCI-ChIL-2-EGFP) was investigated for its distribution and expression after intramuscular (i.m.) injection in chickens. After the i.m. injection, serum distribution was detectable from 2 h post inoculation (p.i.), peaked at 8 h p.i., and disappeared at 7 days p.i. The plasmid DNA was also observed in several organs including heart, liver, lung, spleen, bursa and inoculated muscle at different time points, but at 19 days p.i. the plasmid DNA was not found in any organ except inoculated muscle. Fluorescence of enhanced green fluorescent protein (EGFP) was found in cytoplasm and nucleus of cultured Vero cells, chicken embryo fibroblasts and peripheral blood lymphocytes, which were transfected in vitro with the plasmid DNA or in vivo with Lipofectamine. The expression profile of the fusion gene (ChIL-2-EGFP) in vivo was measured by RT-PCR, ELISA and fluorescence microscopy. The EGFP expression was detected from 8 h p.i. to 14 days p.i. and peaked at 5 days p.i., when the number of EGFP-expression myocytes was about 5% in the injected site. These results demonstrate that intramuscular administration of plasmid DNA leads to widespread distribution and long-term expression in vivo.     

K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

利用DNA重组技术,将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1302中,成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105,为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。     

pcDNA3．0—SV40T重组表达质粒的构建及鉴定

选用pGEM-SV40 T质粒经XhoI单阵切获得SV40 T基因片段,并将其插入pcDNA3. 0载体,构建重组质粒pcDNA3.0-SV40T,为建立永生化细胞系奠定基础。结果表明:经醉切鉴定证实,SV40T基因片段已经成功播入载体中.构建的SV40病毒T杭原重组质粒为利用SV4oT杭原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

影响生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞效果的因素研究

旨在分析生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)转染效果的影响因素,探讨最佳转染条件,为进一步研究生长抑素基因疫苗的作用机制和作用效果奠定基础。以脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞,探讨质粒转染HeLa细胞最佳条件的4个参数:质粒DNA剂量、脂质体剂量、最佳转染时间和质粒提取方法,在荧光显微镜下观察细胞转染情况并计算转染率。结果:在六孔细胞培养板上,当DNA/脂质体剂量为1μg/6μg时,转染效率最高,在转染后72 h达到34.02%;当用Plasmid Maxi Kit试剂盒提取质粒,转染时间为48 h,转染效率最高,达到17.88%。重组质粒pEGS/2SS转染He-La细胞条件是:采用试剂盒(Plasmid Maxi Kit)提取的质粒,DNA和脂质体的剂量分别为1μg与6μg,转染时间48 h,此时的转染效率最高,达17.88%。     

pcDNA3.0-SV40T重组表达质粒的构建及鉴定

选用pGEM-SV40 T质粒经XhoI单酶切获得SV40 T基因片段,并将其插入pcDNA3.0载体,构建重组质粒pcDNA3.0-SV40 T,为建立永生化细胞系奠定基础。结果表明,经酶切鉴定证实,SV40T基因片段已经成功插入载体中。构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。     

E型产气荚膜梭菌ι毒素重组质粒的构建与表达

ι毒素是是公认的引起羔羊、犊牛和家兔患肠毒血症的主要毒素,为了减小其给畜牧业带来重大损失,论文就ι毒素蛋白的构建与表达进行研究,以期对其所引起疾病的预防及疫苗的研发提供参考。通过E型产气荚膜梭菌基因组,利用PCR方法获得大小为1 377bp的iota a基因和2 640bp的iota b基因;随后将目的基因同pET-28a质粒连接构建重组载体,并将重组载体转化E.coli BL21,用IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE、Western blot进行分析,发现Ia、Ib蛋白均成功进行了可溶性表达;最后利用Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了目的蛋白。     

鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建

利用高保真RT-PCR的方法从Poly（I）&#183;Poly（C）诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长Mx cDNA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明：正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。     

牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建

为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。