猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

 【目的】阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性，为疫苗研制提供指导。【方法】利用PCR技术，扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因，并进行克隆、测序及序列分析。【结果】发现7株类M基因长度为1 137 bp，含一个阅读框，CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1 143 bp及1 125 bp。除1株关节炎分离株CP-0104外，引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%，推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源；除CP-0104外，其余8株高变区高度同源。【结论】国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。     

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

 【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90％以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。     

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。     

一株猪源停乳链球菌类马亚种的分离鉴定

【目的】停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）可引起猪关节肿大和运动障碍,大大降低饲料报酬和猪场经济效益,近年研究提示停乳链球菌类马亚种（Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis）是一种潜在的人兽共患病病原。对猪源停乳链球菌类马亚种进行研究,可为防治该病提供数据,具有公共卫生意义。【方法】2022 年 3 月广东省某规模化猪场出现仔猪关节肿大和跛行症状。为确定病因,无菌采集发病仔猪关节液进行细菌分离培养,对优势菌进行形态观察、生化鉴定、16S rDNA 基因序列分析、小鼠致病性试验及抗生素敏感性试验,并对其毒力基因进行 PCR 鉴定。【结果】根据分离菌株的形态特征、生化特性,结合 16S rDNA 序列测定与在线 BLAST 分析结果,确定其为链球菌属的停乳链球菌类马亚种。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢曲松、头孢克洛、青霉素 G、头孢氨苄、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺异恶唑、大观霉素、恩诺沙星敏感,对丁胺卡那、多西环素、多粘菌素 B、诺氟沙星、氨苄西林次敏感,而对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、林可霉素、阿莫西林表现出耐药性。毒力基因 PCR 鉴定结果表明,分离菌株的基因型为 eno+napr+cfb-lmb+bca-bac-scpB+cyl+。小鼠致病性试验结果表明,分离菌株导致小鼠内脏病变和死亡,具有显著的致病性。【结论】首次报道了华南地区有关致病性猪源停乳链球菌病例,研究结果为临床猪源停乳链球菌病的防治提供参考。     

家禽病例中马链球菌兽疫亚种的分离鉴定及致病性观察

为研究马链球菌兽疫亚种对家禽的致病性,采集流行地区发病鸡和鸽的肺脏,分离了8株链球菌,并利用染色镜检、生化试验和PCR方法进行鉴定,结果为3株属马链球菌兽疫亚种,5株属粪肠球菌。在此基础上,选择1株马链球菌兽疫亚种内蒙分离株,经腹腔注射途径人工感染SPF (Specific pathogen free chicken) 鸡和肉鸡,攻毒后死亡率分别为40%和80%。剖检观察到出血性肺炎、气囊炎和心包炎,尤其是肉鸡出现60%的支气管栓塞病变,这与临床病理学变化相似。此外,采用微量肉汤测定法测定8个临床分离菌株测定对15种药物的最小抑菌浓度(Minimum inhibition concentration,MIC),结果显示10株链球菌对于氟苯尼考、莫西沙星、甲磺酸加替沙星、乳酸环丙沙星及强力霉素高度敏感,MIC值均小于7.813 μg/mL。分离株对于泰乐菌素、磷霉素钠、螺旋霉素和阿莫西林高度耐药,MIC值大于250 μg/mL。试验提示马链球菌兽疫亚种可能是家禽气囊炎一个重要的病原之一,临床防治中应使用敏感性高的抗菌素。     

类M蛋白对HEp-2细胞的黏附作用

采用通用的模式细胞HEp 2作黏附及黏附抑制试验 ,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6株类M蛋白的黏附作用。结果表明 ,ATCC35 2 4 6株可以黏附HEp 2细胞。用重组表达的类M蛋白鼠抗血清处理ATCC35 2 4 6 ,可抑制其对HEp 2细胞的黏附 ,最大抑制率达 81 4 % ;而ATCC35 2 4 6的全菌鼠抗血清在 1∶80 0时能完全抑制它对HEp 2细胞的黏附。此外 ,热酸提取的ATCC35 2 4 6株的类M蛋白和重组表达的类M蛋白可不同程度地抑制该菌株的黏附 ,前者在 16 0μg·mL-1有最大的黏附抑制率 ( 4 0 % ) ,而后者在 6 0 μg·mL-1的黏附抑制率可达最高值 ( 2 3% )。结果显示 ,类M蛋白是ATCC35 2 4 6株的黏附素之一 ,在对细胞的黏附过程中发挥作用     

马链球菌马亚种新疆株ZX表面蛋白的提取及免疫原性分析

为研究马链球菌马亚种新疆分离株 ZX 表面蛋白的免疫原性,用化学法提取该菌的表面蛋白,用 SDSG PAGE检测提取的表面蛋白,并将提取的表面蛋白与该菌免疫实验兔后产生的抗体及康复马血清反应,利用 WestG ernGblotting和 ELISA试验分析其免疫原性.结果表明,SDSGPAGE电泳可检测到分子量为45,34,33,30,27,20,16 kDa 7条主蛋白带.提取的7条蛋白带多数可与全菌免疫兔的抗体及康复马体内的抗体发生特异性的结合.用提取蛋白和全菌包被 ELISA对马血清的检测表明,二者的阳性吻合率在86．0％.表明提取的表面蛋白具有理想的免疫原性.     

马链球菌马亚种新疆株SeM基因的克隆及序列差异分析

为研究马链球菌马亚种新疆株SeM基因的分子特征,分析新疆地区马链球菌马亚种的分子流行特征以及为马腺疫的防治提供依据,对分离并鉴定的5株马链球菌马亚种提取基因组、扩增并克隆其SeM基因(GenBank登录号分别为:KJ486792、KJ486793、KJ486794、KJ486795、KJ486796),采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行疏水性、抗原性及三级结构分析,并与Genbank登录菌株的SeM基因序列进行系统进化分析和比较。克隆获得的SeM基因长度为1 530bp,包含1个1 527bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;新疆分离株SeM基因与Genbank登录分离株SeM基因同源性为98.0%~99.4%。结果表明,新疆分离株KJ486793、KJ486796与美国分离株亲缘关系较近,属同一个进化分支,另外3株新疆分离株KJ486792、KJ486795、KJ486794构成一个独立分支。     

牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一,具有细胞因子样功能,在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体,将M17基因插入pET-32a原核表达载体,构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,通过IPTG诱导M17蛋白表达,利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示,IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主;Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1;多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16,经Western blotting分析可见单一目的条带,说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知,M17重组蛋白表达成功,且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

小反刍兽疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的PPRV基因组序列,设计并合成2对特异性引物,以PPRV疫苗株基因组为模板,经RT-PCR扩增获得N和M基因并进行序列分析,再将2个基因插入到原核表达载体pET-28a中,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因,重组菌经IPTG诱导后表达分子质量为57.7ku N蛋白(核衣壳蛋白)和38.1ku的M蛋白(基质蛋白),2个蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。     

拟南芥IAA7的原核表达及稳定性分析

以p GEX–KG为基本骨架,构建了拟南芥IAA7蛋白的原核表达载体,用IPTG诱导IAA7在3种大肠杆菌表达菌株Rosetta、BL21和Tuner中表达,利用GST SefiroseTM resin亲和树脂分离纯化GST–IAA7融合蛋白,并分析重组蛋白在体外保存时的稳定性。结果表明:GST–IAA7融合蛋白在Rosetta菌株中于25℃和0.4 mmol/L IPTG诱导下表达较好;蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)可显著延长GST–IAA7在体外保存的时间,最后利用凝血酶切除GST标签后获得了纯化的IAA7蛋白质。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其抗原性分析

根据GenBank中登录的PCV-2序列,设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去除核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因,经Bam HI和Xho I双酶切后将其插入到表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,并转化到表达菌株Rossetta(DM3)中,采用IPTG进行诱导表达,采用SDS-PAGE薄层灰度分析表达情况,收集菌体,使用GST-Protein Purification Kit亲和层析纯化方法对表达的GST-Cap融合蛋白蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测纯化效果,Western blot分析纯化后的重组Cap蛋白(rCap)免疫学活性。结果表明,成功克隆了大小为579 bp去除核定位信号的ORF2基因,成功诱导表达出预期大小45.3 ku相一致的rCap蛋白,表达量占总菌体的25%,纯化后的rCap蛋白SDS-PAGE电泳分析纯度达到90%以上,Western blot分析表明纯化的rCap蛋白能与PCV-2阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性。     

猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。