拟南芥DWF4基因的内含子影响自身表达

为了进一步确定DWF4 基因的内含子是否影响自身表达,构建了35S启动子驱动的带内含子和不带内含子的DWF4基因表达载体,分别转入拟南芥DWF4基因的弱突变体psc1。对T2代幼苗进行表型分析发现,转入带内含子的DWF4基因的转基因株系TgD4能完全恢复突变体的表型,而转入不带内含子的DWF4基因的转基因株系TcD4只能部分恢复突变体的表型。RT–PCR分析显示,TgD4 的DWF4表达水平明显增加,说明内含子对DWF4基因的表达有增强作用。     

陆地棉COR基因在低温胁迫下的表达分析及功能鉴定

【目的】分析低温胁迫条件下陆地棉中COR家族成员的表达特性,研究参与低温胁迫信号途径的COR基因。【方法】通过Real-time PCR分析低温胁迫条件下,陆地棉COR基因家族成员的表达情况,利用VIGS技术鉴定响应低温胁迫的COR基因功能。【结果】对8个COR基因家族成员在低温条件下的表达分析显示,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因受低温诱导表达水平不断上调,并在处理48 h后表达量较对照上调了近9倍;与之相反,基因序列号为Gh_D06G0147的COR基因在低温诱导3 h左右表达水平出现短暂的上调,但随后其表达受到显著抑制。其余COR基因家族成员的表达受低温胁迫表达水平发生改变,但是随着胁迫时间的增加,转录水平与对照无明显差异。利用VIGS技术在棉花中沉默候选COR基因Gh_D12G0215,并将基因沉默后的棉苗与对照共同进行低温胁迫处理,在相同的处理条件下,Gh_D12G0215基因沉默后的植株与对照相比,对低温胁迫更为敏感,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因可能参与棉花耐低温的调控。【结论】在低温胁迫条件下,陆地棉中部分COR基因的表达受低温胁迫诱导,在陆地棉受到低温胁迫时发挥功能。     

低温胁迫下极地鱼抗冻基因ld4对细胞应激颗粒形成的影响

为研究低温胁迫下抗冻基因ld4对细胞应激颗粒(Stress granules)形成的影响,从南极鱼Lycodichthys dearborn的多聚AFPⅢ基因ld12 c DNA中克隆得到AFPⅢ蛋白四聚体ld4,将其转染到He La细胞中,并采用反转录PCR(RT-PCR)、Western blot方法检测到目的基因ld4在细胞中成功表达,进而采用细胞免疫荧光方法检测细胞在低温(10℃)胁迫下细胞应激颗粒的形成情况。结果表明,与对照组相比较,在低温胁迫下,表达ld4基因的He La细胞中应激颗粒明显减少。研究表明,ld4基因的表达在低温胁迫下能显著降低He La细胞中应激颗粒的形成,试验结果可为ld4基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供理论依据。     

VpSBP3基因负向调控转基因拟南芥盐胁迫抗性

葡萄作为世界上重要的落叶果树,具有较高的经济、生态以及社会效益.近年来,葡萄受到盐胁迫的影响,导致其产量与品质都有所降低.本研究利用同源克隆法获得VpSBP3转录因子,并利用花絮浸染法将其转入拟南芥中获得转基因株系.在盐胁迫下,测定了野生对照、pCAMBIA2300空载体对照和VpSBP3转基因拟南芥株系的萌发率、根长...     

低温胁迫下拟南芥表皮蜡质的响应机制

【目的】低温是影响作物产量和品质的主要环境因素之一,而表皮蜡质是植物抵御外界胁迫的第一层保护性屏障。研究低温胁迫对拟南芥表皮蜡质组分含量、结构及相关蜡质基因表达的影响,有助于进一步理解植物表皮蜡质与低温互作机制,从而对后续作物的抗性机制研究起指导作用。【方法】以野生型拟南芥与蜡质突变体cer1、cer3、cer4、cer6、cer10、cer20及kcs1为试验材料,待植株生长至5-6周时进行4℃胁迫处理10 d和18 d。利用扫描电子显微镜观察表皮蜡质晶体结构变化;利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析蜡质组成及含量变化;利用qRT-PCR技术检测蜡质基因CER1、CER3、CER4、KCS1、WIN1的表达。【结果】低温胁迫后,拟南芥蜡质晶体结构在分布密度、形状与大小方面发生了不同程度的变化。野生型拟南芥蜡质晶体熔融成片,大面积覆盖茎秆表面,这可能一定程度上起到了低温阻隔作用,并减少水分散失。cer1突变体表现出松针状晶体显著减少,并以小型树枝状结构为主;cer3与cer10杆状晶体显著减少;而cer6与cer20蜡质晶体在低温胁迫后有所增加;kcs1蜡质晶体在低温胁迫后垂直杆状结构显著减少,水平杆状结构出现,并伴有蜡质晶体熔融现象。低温胁迫对一级醇减少突变体cer4结构无显著影响。GC-MS分析结果表明,拟南芥野生型与各突变体在低温胁迫下表皮蜡质组分含量也发生了不同程度的变化。野生型中醛类与酮类含量显著减少、一级醇类含量显著增加。各突变体则表现出相反的变化,蜡质组分中醛类、酮类含量增加或无显著变化、一级醇含量减少或无显著变化;受低温胁迫较重的cer3﹑cer10表皮蜡质中一级醇含量显著下降。拟南芥表皮蜡质在低温胁迫下显著积累（cer3 无显著变化、cer10 蜡质总量减少）,且主要通过增加烷类与次级醇含量来增加蜡质总量。低温胁迫诱导了野生型CER1 基因的强势表达,植株通过上调CER1 的表达促进烷类物质的合成以响应低温胁迫;CER4 的表达上调促进了一级醇的合成。KCS1、CER3与WIN1在低温胁迫下表达下调,暗示了植株蜡质总量的增加主要是通过蜡质合成的下游途径如烷合成途径增加。【结论】低温胁迫可以改变表皮蜡质晶体结构及组分含量,蜡质组分中烷类与次级醇类含量的上升是响应低温胁迫的主要方式,蜡质总量的增加主要来自于烷类的增加。CER1是响应低温胁迫的主要蜡质基因。     

玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4克隆及其低温胁迫下的表达模式

[目的]克隆玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4,并明确其组织表达特性及在低温胁迫下的表达模式,为深入研究SUT4基因响应低温胁迫的作用机理提供理论依据.[方法]以玉米自交系黄早四幼苗为材料,采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因,分析其生物学信息,构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其组织表达特异性及低温胁迫(4℃)下不同组织中的表达模式.[结果]克隆获得的ZmSUT4基因(GenBank登录号MK541991)全长为1621 bp,开放阅读框(ORF)长度为1506 bp,编码501个氨基酸,编码蛋白的分子量53.36 kD,理论等电点(pI)8.84,具有12个跨膜结构,定位于细胞膜上,既属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体(GPH)超家族成员,其中第25~447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守结构域,第17~484位氨基酸是GPH超家族成员的蔗糖运转子保守结构域GPH-sucrose.ZmSUT4蛋白的氨基酸序列与单子叶植物SUT4蛋白同源性较高,为86%~96%,聚集在同一分支上;与双子叶植物SUT4蛋白同源性较低,为62%~65%,说明该类蛋白在不同物种间高度保守.ZmSUT4基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,以根中的表达量最高,其次是叶,茎中的表达量最低.低温胁迫下,ZmSUT4基因在不同组织中表达量模式不同,根和叶中ZmSUT4基因表达量均在胁迫24 h达最大值,分别是低温胁迫前(0 h)表达量的2.21和2.62倍,茎中的ZmSUT4基因表达量在胁迫6 h达最大值,是低温胁迫前表达量的3.01倍.[结论]ZmSUT4基因受低温胁迫诱导表达,推测其是调控玉米响应低温胁迫的关键基因.     

剑麻超氧化物歧化酶基因鉴定及低温胁迫表达分析

剑麻是热带地区重要的纤维作物,生产中易受到寒害威胁而造成减产。超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的保护酶,在植物应答低温等逆境条件胁迫过程中起重要作用。前人研究已初步明确超氧化物歧化酶在剑麻低温处理后起重要作用,但其在剑麻中的基因序列及分子调控机制尚未明确。在已发表的剑麻转录组数据库中鉴定出5个SOD基因,遗传进化分析显示其在不同植物物种中进化较保守。实时定量PCR结果显示低温胁迫后5个基因表达模式均呈先上升后下降趋势,且均与SOD活性变化显著正相关（P<0.05）。其中2个CSD基因和1个FSD基因与SOD活性极显著正相关（P <0.01）,表明这3个基因在应答低温胁迫过程中起重要作用。研究鉴定了剑麻SOD基因并初步明确其应答低温胁迫表达模式,为深入开展剑麻抗寒机制研究提供了重要基础。     

低温胁迫对马蹄金抗性生理生化指标的影响

在低温胁迫下，马蹄金叶片内游离脯氨酸含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛含量均发生明显变化。低温处理过程中，随温度降低脯氨酸含量先增后减，在5℃和0℃时，脯氨酸含量处理48h比处理24h有所增加，在-5℃时，2种处理结果差异不明显，随温度降低SOD活性也呈先增后减趋势，在0℃和5℃时，SOD活性处理48h比处理24h高，而-5℃时结果相反，丙二醛含量随温度降低呈递增趋势。     

转rd29A基因国槐试管苗对盐胁迫的生理响应

以转rd29A基因国槐株系及其受体亲本植株为材料,在NaCl胁迫下,分别在处理后不同时间测定了耐盐生理指标.结果表明:在0.6%NaCl胁迫下,国槐植株内可溶性糖含量、脯氨酸含量,丙二醛(MDA)含量以及相对电导率都随NaCl胁迫时间的延长而增加;与受体亲本植株材料相比,转基因株系的可溶性糖和细胞膜稳定提高,丙二醛、脯氨酸含量降低.说明转rd29A基因的国槐植株耐盐性得到提高.     

低温胁迫下转ipt基因水稻某些生理特性研究

测定了特异戊烯基转移酶（ipt）基因水稻EY105的株系T7、T19及对照在低温胁迫下幼苗叶片叶绿素含量、脯氨酸含量及膜保护酶活性。结果表明,常温下,转基因植株除叶片脯氨酸含量比对照低外,所测定的其他生理生化指标没有显著差异;经低温胁迫后,对照植株叶片叶绿素含量降低35．2％,转基因水稻植株基本保持不变,2个转ipt基因的水稻株系脯氨酸含量分别增加60．89％及73．46％,对照植株仅增加11．0％;低温胁迫后对照植株的POD及SOD活性分别下降27．0％及8．3％,MDA增加82．6％,而转基因水稻植株未发生变化。     

rd29A和CaMV-35S启动子调控转AtDREB2A苜蓿耐碱性分析

rd29A和CaMV-35S启动子广泛应用于植物基因工程中,但调控效果在不同转基因植物中不同。文章采用Real-time PCR分析转基因各株系中AtDREB2A基因表达差异;对苜蓿扦插苗及一年生转基因苜蓿成苗分别作50 mmol·L~(-1)NaHCO_3(pH 8.0)和混合盐碱土(pH 9.3)处理,统计苜蓿各株系成活率、开花植株数,测定叶绿素、丙二醛、相对电导率及根系活力。结果表明,两种启动子对AtDREB2A表达的调控存在明显差异,35S启动子调控的AtDREB2A为超量表达,碱胁迫处理后显著上调,达57.6倍;rd29A启动子调控AtDREB2A诱导表达,表达量低于35S启动子调控株系(20.7倍),AtDREB2A超量表达抑制植株正常生长。在幼苗期和成苗期,两种启动子各转基因株系均有一定耐碱能力,但存在差异。AtDREB2A诱导表达耐碱性效果更明显,其叶绿素含量、相对电导率、MDA、根系活力变化均显著低于AtDREB2A超量表达。研究两种启动子调控的转AtDREB2A基因苜蓿耐碱效果,为AtDREB2A基因在苜蓿耐碱基因工程中应用提供方法。     

鳞头犬牙南极鱼atp6v0c基因在HeLa细胞中抗寒功能的研究

为探求南极鱼ATP酶类在低温适应下的作用,从鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawsoni的c DNA文库中克隆atp6v0c基因(dmatp6v0c),并转染到He La细胞中,通过流式细胞仪检测细胞在低温胁迫下(10℃)的死亡率,获得了dmatp6v0c基因的全部编码序列,其长度为462 bp,并将其插入到真核表达载体pc DNA3.1(-)上用于体外表达。结果表明,与对照组相比,在低温胁迫下,过表达dmatp6v0c基因的He La细胞死亡率从(19.23±1.87)%显著降低到(8.13±0.04)%(P0.05)。研究表明,在低温胁迫下dmatp6v0c基因过表达能显著降低He La细胞的死亡率,试验结果可为dmatp6v0c基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供理论依据。     

自然低温对籼稻恢复系及其杂交组合耐冷性的影响

采用田间分期播种的自然低温胁迫方法,以相对冷敏指数(CR I)为评价指标,对籼稻恢复系明恢63(R1)、蜀恢527(R2)、绵恢725(R3)、绵恢746(R4)和辐恢838(R5)及其15个不完全双列杂交组合障碍型耐冷性的影响进行了初步研究。结果表明,1)不同恢复系R1~R5及其杂交组合对低温的敏感程度存在显著差异,其中,R5表现耐冷性强,而R3、R1和R2均表现为弱;2)在一定的低温胁迫下,同一个恢复系与不同不育系和不同恢复系与同一不育系组配系列杂交组合之间的平均结实率和CR I值的差异达到极显著水平,其耐冷性强弱前者呈A/R5>A/R3>A/R2>A/R1>A/R4趋势,后者呈A3/R>A1/R>A2/R的趋势,表明杂交水稻低温障碍型耐冷性的表达既与恢复系有关,又受不育系影响;3)在一定低温胁迫下,恢复系与其相应杂交组合的耐冷性之间存在显著正相关关系。其中R1、R2、R3和R5与其对应杂交组合之间CR I值的相关系数分别为0.9986**、0.5145*、0.1660和0.8965**。     

独行菜抗冷相关基因的克隆及表达分析

【目的】独行菜在种子萌发和幼苗生长阶段可耐受一定程度的低温胁迫,研究独行菜的低温耐受机制。【方法】设计兼并引物,从独行菜冷诱导叶片的cDNA中克隆获得LaCBF3和LaCOR15a基因核心片段。利用半定量RT-PCR法分析两个基因在不同胁迫处理下的表达情况。【结果】获得442 bp LaCBF3及405 bp LaCOR15a核心片段,经比对与拟南芥CBF3、COR15a基因核心片段相似性分别为84.38%、81.8%。半定量RT-PCR结果显示在独行菜幼苗中,LaCOR15a基因不仅响应低温胁迫,还能迅速响应高盐、干旱及ABA处理,不同条件下表达各有差异。LaCBF3仅对低温胁迫响应迅速。【结论】LaCBF3、LaCOR15a在独行菜幼苗响应低温胁迫的分子机制中具有重要的调控作用,且LaCOR15a基因也应答干旱、高盐等非生物胁迫。     

冷应激引起鸡下丘脑基因表达谱差异分析

为研究冷应激发生机制以及冷应激过程中下丘脑神经内分泌系统基因表达变化,选取28日龄淮南麻黄鸡为研究对象,采用全基因组表达谱芯片技术分析冷应激24 h后下丘脑组织差异表达基因.通过比较淮南麻黄鸡冷应激24 h前后下丘脑组织基因表达谱,表达倍数＞3倍的基因共877个,其中下调基因334个,主要涉及HAAO、CHRNA9及STAM2等信号转导接头分子基因的低表达;上调基因543个,主要为CCK、NPY及其受体基因、CAMK2A、SST及TRH等基因.对差异表达基因参与的生物学过程分析可见,在冷应激24 h过程中,鸡下丘脑首先启动神经受体-配体相互作用,刺激鸡体产生采食欲望,随后启动脂质代谢途径以供应机体能量需求.在此过程中,Jak-STAT、Ca离子信号通路等一系列生物反应途径发生响应,以调节机体对寒冷应激的反应.差异表达基因的生物学通路分析为阐明鸡冷应激机理提供重要信息,差异表达基因分析有助于抗冷应激分子育种候选基因筛选.     

用cDNA-AFLP技术研究茶树种子在低温贮藏过程中差异基因的表达

以茶树无性系龙井43种子为材料,利用cDNA-AFLP差异显示方法,分析它在低温贮藏后的基因表达,为顽拗性植物种子的中长期保存提供理论依据。从64对引物筛选出的差异片段中克隆出10个低温差异表达片段,有7个在GenBank数据库中与小分子量热激蛋白、MYB类转录因子、衰老相关蛋白、F-box家族蛋白、蛋白激酶、磷酸二酯酶等基因有较高同源性。     

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 DREB1A基因导入植物奠定基础     

玉米中3个CIPK同源基因在干旱和低温胁迫下的表达分析

应用生物信息学分析,筛选获得了玉米中的3个CIPK基因同源序列(登录号分别为AY104819,EU974290和EU968441),它们编码的氨基酸序列都具有CIPK家族典型的功能结构域,推测属于CIPK家族成员.根据同源性,分别将它们暂命名为ZmCIPK1、ZmCIPK17和ZmCIPK18.RT-PCR分析结果表明...     

Developing transgenic maize (Zea mays L.) with insect resistance and glyphosate tolerance by fusion gene transformation

Using linker peptide LP4/2A for multiple gene transformation is considered to be an effective method to stack or pyramid several traits in plants. Bacillus thuringiensis(Bt) cry gene and epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) gene are two important genes for culturing pest-resistant and glyphosate-tolerant crops. We used linker peptide LP4/2A to connect the Bt cry1 Ah gene with the 2m G2-epsps gene and combined the wide-used man A gene as a selective marker to construct one coordinated expression vector called p2 EPUHLAGN. The expression vector was transferred into maize by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and 60 plants were obtained, 40% of which were positive transformants. Molecular detection demonstrated that the two genes in the fusion vector were expressed simultaneously and spliced correctly in translation processing; meanwhile bioassay detection proved the transgenic maize had preferable pest resistance and glyphosate tolerance. Therefore, linker peptide LP4/2A provided a simple and reliable strategy for producing gene stacking in maize and the result showed that the fusion gene transformation system of LP4/2A was feasible in monocot plants.