基于单因素试验的大豆CDDP-PCR反应体系优化

[目的]优化大豆CDDP-PCR反应体系。[方法]采用单因素试验方法对影响大豆CDDP-PCR反应的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、d NTPs浓度和模板DNA用量等因素进行优化。[结果]优化后的大豆CDDP-PCR体系为:Mg2+浓度2.0 mmol/L、Taq聚合酶用量1.5 U、引物浓度0.375μmol/L、d NTPs浓度0.3 mmol/L、DNA模板用量40 ng。运用24个大豆品种验证了该反应体系稳定、可靠。[结论]该反应体系的建立为大豆种质遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种奠定了基础。     

微齿菝葜CDDP-PCR体系优化、引物筛选及多态性分析

利用正交试验对微齿菝葜CDDP-PCR反应体系的模板DNA和引物浓度进行优化。最优CDDP-PCR反应体系为:2×Es Taq MasterMix酶(含染料) 10μL,0.4μmol/L引物,40 ng DNA模板,ddH_2O补齐至20μL。利用该优化体系从21条通用引物中共筛选出12条条带清晰、多态性好的引物。利用筛选好的引物对105个微齿菝葜样品进行扩增,共得到229个位点,其中多态性位点225个,占总位点数的98.25%。本试验表明CDDP分子标记对于微齿菝葜的遗传多样性分析、分子图谱构建及性状基因连锁研究具有重要价值。     

金柑属ISSR反应体系的建立及优化

以融安金弹(F.crassifolia Swingle)为试材,利用正交设计和单因素试验相结合的方法,对ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化筛选,结果表明,20μL的ISSR反应体系中各组分的最适浓度分别为:Mg2+1.60 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,TaqDNA酶1.0 U,引物0.2μmol/L模板1.2 ng/μL.并利用该优化对金弹等21份金柑属材料进行了ISSR扩增,证实了该体系稳定和可靠性.     

金柑属ISSR反应体系的建立及优化

以融安金弹（F．crassifolia Swingle）为试材,利用正交设计和单因素试验相结合的方法,对ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化筛选,结果表明,20μL的ISSR反应体系中各组分的最适浓度分别为：Mg^2＋1．60mmol／L,dNTPs0．15mmol／L,TaqDNA酶1．0U,引物0．2μmol／L模板1．2ng／μL．并利用该优化对金弹等21份金柑属材料进行了ISSR扩增,证实了该体系稳定和可靠性．     

油菜RAPD反应体系的优化研究

针对RAPD反应体系中Taq聚合酶，dNTP和引物这3个影响较大的因素，设计了一组3因素3水平试验，根据试验结果，筛选了油菜random amplified polymorphic DNA(RAPD)反应体系中3因素的最佳浓度配比，即Taq 1.6U,dNTP 0.2mmol/L，引物0．3umol/L。     

黄芪SRAP反应体系优化

以黄芪为材料,对黄芪SRAP反应体系进行优化.黄芪最佳SRAP反应体系为,在20 μl反应体积中含:模板DNA 15 ng,引物0.2 μmol/L,dNTP 200 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,Taq DNA聚合酶 1 U,1×Buffer;反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;最后72 ℃延伸5 min.     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

樟树RAPD反应体系的优化

以樟树叶片提取的基因组DNA为材料,对影响其RAPD-PCR各种反应条件的因子进行研究。结果表明:PCR反应时,总反应液20μL中基因组DNA浓度为8 ng/μL,镁离子浓度为2.0 mmol/L,dNTP浓度为0.2 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/(20μL)时,出现可辨认的鲜明谱带,为RAPD分析应用于樟树遗传多样性研究和良种选择打下良好的基础。     

月季ISSR反应体系的优化

以萨曼莎月季为材料,对影响ISSR-PCR扩增的主要影响因子进行了优化,建立了适于月季的ISSR反应体系:25μl反应体积中,1×Buffer、1.5 mmol/L Mg2 、1 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、0.48 mmol/LdNTPs、20 ng模板DNA;并将该优化体系应用于其他5个ISSR引物和6个月季品种,证实了该体系的适用性和稳定性。     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

芒果CDDP分子标记正交优化设计及引物筛选

以芒果基因组DNA为模板,选择正交设计试验对控制DNA保守序列多态性——聚合酶链式反应(CDDP-PCR)的4个因素(模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)DNA聚合酶用量)进行正交试验,构建了较佳的芒果CDDP-PCR反应体系,含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L~(-1)d NTPs、1.00μmol·L~(-1)引物、0.50 ng·μL~(-1)模板DNA,加双蒸水使得总体积达20.00μL.对比四因子对PCR反应的影响,影响最强的因素是含Mg2+的DNA聚合酶,影响最弱的因素是模板DNA.利用供试的20个芒果品种验证了该体系的稳定性和可行性,21条CDDP引物均可扩增出明晰整齐的条带.     

金柑组织培养与快速繁殖体系的建立

为了建立金柑(Fortunella japonica (Thunb.) Swingle)组织培养与快速繁殖体系,本研究以金柑胚根、子叶、茎段、叶片等不同外植体为材料,采用器官发生型以及短枝扦插型为主要培养途径,进行金柑的组织培养,研究不同浓度的植物生长调节剂对金柑快速繁殖体系建立的影响以及愈伤组织诱导和分化的最适条件,筛选出诱导愈伤组织形成不定芽的最佳外植体与最适培养基。研究结果表明,金柑诱导愈伤组织形成不定芽的最佳外植体为幼嫩的茎段,诱导金柑子叶形成愈伤组织的最佳培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA+3% 蔗糖+0.7% 琼脂,诱导子叶愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+3% 蔗糖+0.7% 琼脂。由此证明上述组织培养途径是可行的。     

尤溪金柑离体再生体系优化及试管苗保存

以尤溪金柑试管苗为材料,采用双因素试验设计,筛选出适合尤溪金柑试管苗增殖和生根的培养基;采用L3（3^4）正交表设计,研究each、甘露醇和多效唑对尤溪金柑试管苗保存的影响．结果表明：芽增殖的最优培养基为：MS＋1．2mg·L-1 6-BA＋0．05mg·L-1NAA,增殖系数最高,达10．60;生根最优培养基为：MS＋0．3mg·L-1NAA十0．2mg·L-1 IBA。生根率最高达到了83．33％．保存12个月时处理C4（MS＋0．44g·L-1 CaCl2＋0g·L-1甘露醇＋1．0mg·L-1多效唑）中尤溪金柑试管苗的存活率均为最高,达97．8％．     

马褂木ISSR-PCR扩增体系的优化

【目的】建立稳定的马褂木ISSR-PCR扩增体系,为马褂木种群ISSR多样性分析提供技术支持。【方法】采用单因素试验对ISSR-PCR扩增体系中的MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板用量和退火温度等主要因素进行筛选优化。【结果】采用试剂盒方法提取马褂木叶片DNA的效果优于改良CTAB法,最优PCR反应体系为：总体积20.0μL中含有10×Buffer2.0μL、MgCl21.8mmol/L、dNTPs0.2mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00U、DNA模板60ng、退火温度59.1℃。【结论】优化后的马褂木ISSR-PCR扩增体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可满足马褂木种群ISSR多样性分析的要求。     

珍稀濒危植物香果树ISSR-PCR反应体系的筛选与优化

以珍稀濒危植物香果树(Emmenopterys henryi)基因组DNA为研究对象,测试了ISSR-PCR反应体系的最适退火温度,并通过对反应体系中的Mg2 、dNTP浓度、模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物浓度的筛选和优化,获得了香果树ISSR分析较适宜的扩增条件是:10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol·L-1 Tris·HCl pH9.0,50 mmol·L-1 KCl,0.1%Triton X-100),2.0 mmol·L-1 MgCl2,0.75 U Taq酶,10 ng模板DNA,12 pmol引物;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.2 mmol·L-1,2 mg·mL-1牛血清白蛋白.香果树的合适退火温度为48.5℃.     

松毛虫mtDNA PCR反应体系优化

为了应用线粒体DNA研究松毛虫种群的遗传结构,本研究采用正交试验设计法L16(45)对影响松毛虫mtDNA PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验并对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了单因素梯度比较优化。建立了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳体系即在50μL体系中含模板150 ng、0.10μmol/L引物、0.4 mmol/L dNTP、1.0UTaq DNA聚合酶、2.5 mmol/LMg2+。同时通过PCR比较,确定最佳循环次数为35个循环,最佳退火温度为56℃,获得了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳扩增程序。     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

响应面分析法优化金柑多糖的提取工艺

采用响应面分析法优化金柑多糖的提取工艺,研究液料比、温度、时间、乙醇含量和提取次数5个因素对多糖提取率的影响,利用SAS 9.2响应面的分析程序得到回归方程.结果表明,所得的方程达到显著水平,多糖的最佳提取工艺条件为:液料比(毫升∶克)38∶1、提取温度88℃、提取2.5 h、乙醇含量70%和提取3次,实际测得的多糖提取率为1.81%,与理论预测值基本一致.