草莓miR156靶基因SPL9的克隆与表达分析

 【目的】从草莓中克隆SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子基因SPL9,并分析其在草莓植株不同生长时期的表达水平及与miR156的表达关系,探讨SPL9在草莓植株生长发育中的作用。【方法】根据苹果SPL基因家族的保守序列设计简并引物,以草莓叶片为试材,利用RT-PCR克隆草莓SPL9基因片段,在此基础上利用RACE方法克隆SPL9的cDNA全长。利用实时定量RT-PCR技术分析草莓叶片中SPL9及miR156的表达水平。【结果】从草莓（Fragaria×ananassa）品种‘全明星’中克隆出SPL9基因的cDNA全长序列,命名为FaSPL9。其CDS长度为1 143 bp,编码381个氨基酸,与拟南芥AtSPL9、葡萄VvSPL9、枳PtSPL9、苹果MdSPL9以及玉米ZmSPL9的氨基酸序列同源性分别为：40.30%、64.57%、56.09%、70.33%,38.35%。FaSPL9有着高度保守的SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。FaSPL9基因序列中包含miR156的靶位点,实时定量RT-PCR结果表明,在草莓植株的不同生长时期FaSPL9的表达量不同,且与miR156呈现相反的表达模式。【结论】从草莓中分离出FaSPL9基因,其作为miR156的靶基因,推测FaSPL9对草莓植株的生长发育具有重要的调控作用。     

赤霉素处理影响草莓成花的解剖学研究

赤霉素(GA3)处理茎尖分生组织处于成花诱导前后的草莓植株,较全面地报告了由此引起的草莓植株发育状况、成花情况、花芽分化进程以及分化状态等内容,并且对不同时期处理所引起的成花逆转、成花抑制以及成花延迟等现象进行了分析,旨在为进一步深入研究激素调控草莓花芽分化奠定基础。     

大果四季草莓栽培

大果四季草莓连续成花结果，适合南北各地种植，既适宜春、夏、秋露地栽培，又适宜冬季保护地栽培，先将栽培技术介绍如下：     

宗地花猪心脏型脂肪酸结合蛋白基因的表达

为有效提高宗地花猪的肉品质,合理评价养殖模式提供理论依据,参照GenBank中猪H-FABP基因序列设计引物,以猪18SRNA为内参基因,应用实时荧光定量PCR方法检测H-FABP基因在不同饲养条件下宗地花猪不同组织器官中的表达量。结果表明:H-FABP基因在肺脏、心脏、肾脏、小肠、脾脏、肝脏、背最长肌、腰大肌中均有表达,但不同饲养条件下其表达水平各异,放养型背最长肌腰大肌肾脏心脏小肠肺脏脾脏肝脏,背最长肌中表达量显著高于其他组织(P0.05);圈养型腰大肌脾脏心脏肺脏小肠肝脏背最长肌肾脏,腰大肌中表达量显著高于其他组织(P0.05),肝脏中表达量高于背最长肌(P0.05)。两种饲养条件下宗地花猪肺脏、肝脏中表达量相当,而在心脏、肾脏、小肠、脾脏、背最长肌中表达差异较大。     

东北狍PTN基因cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲水性蛋白质,其二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,分别占46.71%、32.34%和20.96%;生物信息分析发现,东北狍PTN基因在进化上较为保守,与其他物种同源性均89%;构建的进化树表明,东北狍PTN基因与野牦牛、绵羊、野猪等偶蹄目动物亲缘关系较近,这一结果符合经典分类学规律;实时荧光定量RT-PCR分析显示,PTN基因在狍茸顶端组织不同生长层表达量存在显著差异,其中前软骨和间充质组织层的表达量明显高于皮肤和软骨组织层。     

大果四季草莓栽培技术

<正>大果四季草莓连续成花结果,适合各地种植,既适宜春、夏、秋露地栽培,又适宜冬季保护地栽培。一、园址选择草莓喜光、喜肥、喜水、怕涝,宜选择地势较高、地面平坦、土壤疏松、肥沃、酸碱适宜、通风良好的地片建园。既可建立专门的草莓园,也可利用幼龄果园行间间作。     

葡萄microRNA156b和microRNA172c及其靶基因在冬芽二次成花过程中的表达特性研究

利用半定量RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术检测‘藤稔’葡萄microRNA156b(Vv-miR156b)和microRNA172c(Vv-miR172c)及其靶基因(Vv-SPL9和Vv-AP2)在摘心处理(5月14日、5月20日、5月28日)后不同发育时期冬芽中的表达情况,并利用RLM-5’-RACE验证了miRNAs作用其靶基因的方式。结果表明:仅5月28日摘心处理的冬芽能够进行花芽分化并形成花序,而其他处理及对照未能花芽分化。2种RT-PCR检测结果基本一致,5月28日摘心处理的2条miRNAs表达水平明显下降,且花序中有最低表达。相应的靶基因在冬芽二次成花过程中的表达水平呈现出与其miRNAs相反的变化趋势。RLM-5’-RACE结果显示,2条miRNAs介导靶基因裂解,裂解位点均在miRNAs 5’端的第10和11位碱基之间。表明microRNA156b和microRNA172c通过介导相应靶基因的裂解调控其靶基因的表达,从而影响葡萄冬芽的二次成花。     

大果四季草莓栽培技术

大果四季草莓连续成花结果,适合各地种植,既适宜春、夏、秋露地栽培,又适宜冬季保护地栽培. 一、植前整地 草莓喜光、喜肥、喜水、怕涝,宜选择地势较高、地面平坦、土质疏松、土壤肥沃、酸碱适宜、通风良好的地块建园.既可建专门的草莓园,也可利用幼龄果园行间进行间作.     

鹿茸不同生长期MALAT1基因的差异表达

以不同生长期的鹿茸尖端组织为材料,采用mRNA差异显示技术检测不同生长期鹿茸尖端间充质组织的差异表达基因。对其中一条差异表达片段进行克隆测序分析,得到400 bp左右的片段,与野猪的非编码基因MALAT1有高度同源性,同源性为90%。进一步实时荧光定量RT-PCR鉴定发现,该基因在鹿茸生长发育的前期和中期表达量高于后期,该基因在鹿茸快速生长期的上调表达暗示其在鹿茸生长发育过程中发挥作用,是鹿茸生长发育相关基因的候选基因。     

用实时荧光定量RT-PCR方法定量绵羊PrP基因的表达

为快速、准确定量绵羊PrP基因的mRNA,建立了绵羊PrP基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法。根据已报道的绵羊PrP基因序列,设计合成引物;采用RT-PCR方法扩增目的片段;构建标准重组质粒制备标准曲线,用于样品检测。结果发现,中枢神经系统组织PrP基因的表达量(copies/ng总RNA,39420)比外周组织(为7845)的高;在中枢神经系统中,脑干的PrP基因的表达量最高(为67020);外周器官中,淋巴结PrP基因的表达量最高(为29086),肾脏的表达量最低(为125)。建立绵羊PrP基因实时荧光定量PCR方法,对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析,为进一步研究绵羊组织器官的PrP表达在传染性海绵状脑病发生中的作用提供基础数据。     

鹿科动物茸角组织Osteopontin基因全长cDNA的克隆及表达分析

骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是在骨基质的矿化和吸收过程中起重要作用的细胞因子,研究首次从梅花鹿鹿茸尖端组织cDNA文库中成功克隆了OPN基因的全长cDNA序列,并结合生物信息学方法和实时荧光定量RT-PCR技术对该基因的氨基酸序列及表达特征进行分析。结果表明,OPN的cDNA全长为1 406 bp,编码279个氨基酸。经生物信息学分析,该基因为不稳定蛋白,具有N端信号肽,相对分子质量为30.99 ku,理论等电点为4.40,其一级结构中丝氨酸和谷氨酸残基所占比例最高,含有特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD)。同源序列比对及系统进化树分析表明,鹿源OPN氨基酸序列不仅与欧洲牛和山羊相似性最高(分别为86%,85%),且在该基因座位上也与二者在亲缘关系最近。实时荧光定量RT-PCR分析表明,OPN基因在鹿茸尖端不同组织层的表达存在差异,前软骨层和软骨层的表达量普遍高于间充质和皮肤层,推测OPN可能通过介导破骨细胞与矿化组织的黏附,从而参与了鹿茸组织的矿化。     

siRNA干涉禽流感病毒PA基因在鸡胚成纤维细胞中的表达

用阳离子脂体质转染试剂将人工合成的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)转染鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明,针对禽流感病毒(AIV)H5N1亚型核蛋白(NP)基因的siRNA能在AIV感染后1,2,3 h显著抑制NP基因的表达,表达水平分别降低3,1.4和2.5倍.     

春兰GLO基因的克隆和实时定量表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到一个GLO基因.该基因含有一个630 bp的开放阅读框(ORF),共编码210个氨基酸.系统进化树分析显示,该基因属于B类MADS-box基因的PI/GLO家族,其编码的蛋白与其他植物PI/GLO类蛋白具有很高的同源性,命名为CgGLO(登录号HM106984).实时荧光定量表达分析表明,CgGLO主要在第二轮花器官唇瓣和花瓣中表达,在萼片、子房和叶片中表达较少,在蕊柱和根中表达量最少,这种表达模式支持了van Tunen对ABC模型的修正,也显示了CgGLO基因可能在春兰花器官以及子房的形成过程中起着重要作用.     

斑节对虾cdc25基因的表达分析

在已构建的斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组cDNA文库中筛选了cdc25基因的EST序列,使用实时荧光定量PCR获得了cdc25基因在雌性个体不同组织及卵巢不同发育阶段的表达情况。结果表明:cdc25基因在雌性个体的卵巢、淋巴、脑神经、血、肌肉、心脏、鳃、肝胰腺和肠9种组织中均有表达,并存在显著性差异,其中心脏的相对表达量最高。同时,cdc25基因在卵巢发育6个时期的时序表达结果显示,cdc25基因在卵巢中的相对表达量在Ⅰ期最大,与其他5期存在显著差异,而后骤降,直到Ⅴ期才稍微升高,随后又逐渐降低。     

森林草莓精氨酸脱羧酶基因的电子克隆与序列分析

从森林草莓中分离精氨酸脱羧酶基因(FvADC),分析其表达模式、序列特征和进化关系。采用电子克隆结合RT-PCR分离FvADC;半定量RT-PCR检测其在盐、热、冷胁迫下的表达情况;生物信息学分析FvADC的结构与进化。结果获得FvADC cDNA全长,包括2 154 bp的编码区,RT-PCR验证编码区序列与电子克隆...     

LEPR基因在贵州白山羊组织中的表达

为探究瘦素受体基因(LEPR)在贵州白山羊组织中的表达规律,利用实时荧光定量PCR技术检测LEPR基因在贵州白山羊心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌和皮下脂肪9个组织的表达量。结果表明:目的基因LEPR和内参基因GAPDH的熔解曲线均呈单一峰形,说明所选条件可准确定量LEPR基因在贵州白山羊各组织中的相对表达量。具体表达量为脂肪脾肺背肌肠肝肾心腿肌。     

转基因枳橙中rolABC基因荧光定量表达分析方法的建立

以转rolABC基因枳橙B、D、E系及野生植株为材料,制备标准品,采用SYBR Green I染料,构建rol基因和β-actin基因的双标准曲线,校正引物扩增效率后,用2-△△Ct法对rol基因在嫩茎、嫩叶、功能叶、树皮和根中的mRNA水平进行相对定量,建立适合于rolA、rolB、rolC基因实时荧光定量RT-PCR分析方法.初步认为rolC基因在嫩茎、嫩叶、功能叶和树皮中表达量最高;其次是rolA基因,主要在嫩茎中表达;rolB基因表达量最低,主要在根系中表达.     

在水稻纹枯病菌菌核形成中5个基因的表达差异分析

以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)菌株GD118不同生长时期的总RNA为材料,以18SrRNA作为内参基因,根据实验室抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)已获得的立枯丝核菌基因片段的表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)设计引物,采用实时定量RT-PCR检测A、B、C、E、F基因(分别为双组分反应调节子、激活巨噬细胞糖蛋白、胞外金属弹力蛋白酶、亲环蛋白、内质网囊泡蛋白ERV29)的表达,以期找到水稻纹枯病菌菌核形成中的差异表达基因。结果表明:从菌核开始形成到菌核成熟的过程中,这5个基因的表达量逐渐降低,且菌核在成熟时表达量最低,但成熟后这些基因的表达量迅速恢复到之前的水平,之后表达量基本保持不变。提示这5个基因在水稻纹枯病菌菌核形成的不同时期的表达有显著差异,说明这5个基因可能受菌核形成过程中胁迫条件的诱导表达。     

金银花花器官实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选金银花花器官基因表达分析的适宜内参基因,试验以金银花花器官6个时期为材料,选取金银花的9个候选内参基因Lonja.ACT11,Lonja.ACT2/7,Lonja.G6PD,Lonja.GAPDH,Lonja.MTP,Lonja.TUA,Lonja.UBQ10,Lonja.EF1A,Lonja.UBC,利用q RT-PCR技术及Ge Norm,Norm Finder软件对它们的表达稳定性进行分析评价。结果表明,Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD在金银花花器官生长的不同时期表达水平较稳定,运用q RT-PCR研究金银花花器官基因表达时可选用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD组合作为内参基因。