不同类型烟草种质的烟碱含量变化与相关基因表达水平

为研究不同类型烟草种质的烟碱含量变化规律与相关基因的表达情况,以烤烟K326、香料烟巴斯玛、白肋烟TN90、晾烟马里兰为材料,采用荧光定量PCR技术,测定了烟草不同生育时期上部叶、中部叶、下部叶的烟碱含量与烟碱代谢过程中相关基因CYP82E5V2、PMT、A622、QPT的表达水平。结果表明,随着生育期的推进,烟碱含量缓慢上升,打顶后急剧增加,除巴斯玛打顶后还继续上升外,K326、TN90和马里兰烟均表现为:打顶后烟碱含量急剧增加,后缓慢下降,再渐趋平稳。不同类型烟草种质的PMT在不同生育期均有表达,苗期PMT表达量较高,其变化趋势与烟碱含量的基本一致;QPT在烟草发育前期表达量较高,而后下降,至打顶前1周表达量出现一个峰值,打顶后表达量持续增加,与烟碱含量变化呈正相关;K326和马里兰烟的A622表达量呈波浪型上升,至成熟时仍维持较高水平,而TN90和巴斯玛在打顶前后1周表达量较高,后表达下降再上升,成熟时表达量较低,与烟碱含量变化无明显一致性;CYP82E5V2表达量在不同生育时期均维持在较高水平,呈波浪型,生长旺期时表达上升,打顶前后均出现峰值,但巴斯玛成熟期时其表达量下降,打顶前CYP82E5V2表达量与烟碱含量变化呈正相关,打顶后期至成熟期两者呈一定程度的负相关。     

烟草烟碱含量研究进展

综述了国内外有关烟叶烟碱含量的研究进展,阐述了烟株体内烟碱的合成与积累,并探讨了影响其合成的因素和调控措施。     

高烟碱烟草种质资源筛选试验初报

对90份烟草种质资源进行了烟碱含量的分析测定,在试验条件下,筛选出烟碱含量高于5.0%的烟草种质1份,烟碱含量在4.0%～5.0%之间的烟草种质8份.在参试的娴草种质资源中,密节金丝尾的烟碱含量最高,为5.1385.     

白肋烟烟碱转化率与生物碱含量及新烟草碱/降烟碱值的关系

研究了达白1号和鄂烟1号生长早期烟碱转化诱导后烟叶及调制后烟叶烟碱转化率与生物碱含量和新烟草碱/降烟碱值(Anat/Nnic)的关系.结果表明,烟碱转化率与烟碱含量呈显著负相关关系,与降烟碱含量呈显著正相关关系,随着烟碱转化率的增加,新烟草碱和假木贼碱含量无显著变化.烟碱转化率与Anat/Nnic存在极显著的幂函数关系.早期诱导烟叶的Anat/Nnic在低于0.8时,烟碱转化率开始显著增加,其对应的烟碱转化率为2.5%:调制后烟叶Anat/Nnic在小于1.1时烟碱转化率显著增加,对应的烟碱转化率为2.8%～2.9%.     

高效液相色谱法测定烟草中烟碱含量

[目的]建立一种高效液相色谱法测定烟草中烟碱的含量。[方法]色谱柱KromasiL C18(250.0 mm×4.6 mm,5.0μm),流动相为甲醇:0.02 mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液(用磷酸调节pH 6.0)=70∶30;检测波长259 nm;流速1.0 mL/min;进样量20μL;柱温30℃。[结果]溶液浓度在27.568～165.408 mg/L时峰面积与烟碱浓度呈良好的线性关系,相关系数r为0.999 0,方法的检测限(s/n=3)为0.011 mg/L,平均回收率为97.9%,相对标准偏差(RSD)为1.1%(n=5)。[结论]该方法简便易行,结果准确,可作为烟草中烟碱含量的检测方法。     

高效液相色谱法测定烟草中烟碱含量

为了提高液相色谱在烟草行业的应用,建立了高效液相色谱法测定烟草中烟碱含量的分析方法。烟末样品经过0.01 mol/L的氢氧化钠溶液萃取,以等体积甲醇和0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液作流动相,在259 nm的波长下分析,用外标法定量。结果表明,烟碱含量在0~350 mg/L浓度范围内,线性关系良好,R~2=0.999 1,回收率为95.7%~103.2%。该法具有快速、简单、准确、灵敏等特点,适用于样品的批量检测。     

烟草烟碱含量性状的杂种优势及配合力分析

为拓宽烤烟烟碱性状改良的种质资源范围,以4种烟草类型13个品种为亲本材料,采用NCII遗传交配设计,组配40个杂交组合,田间种植并测定亲本及杂种F1的烟叶烟碱含量,对烟叶烟碱含量差异、杂种优势表现、烟碱的配合力进行分析。结果显示:不同类型及品种间的烟叶烟碱含量差异极显著,其中白肋烟品种TN90的烟碱含量最高、为5.21%,晒晾烟品种青梗的烟碱含量最低、为0.94%。烟碱含量性状的杂种优势表现多样,40个杂交组合中,表现为正向超亲优势的组合有15个、占37.5%,其中优势最强的组合是G70×湄潭大蛮烟,优势率为54.35%;表现为负向超亲优势的组合有10个、占25%,其中优势最强的组合是红花大金元×湄潭大蛮烟,优势率为-26.71%;表现为中亲优势的组合有15个、占37.5%。亲本材料间烟碱含量的一般配合力差异显著,其中一般配合力效应值最高的是巴斯玛、为21.35,最低的是青梗、为-15.77;组合间烟碱含量的特殊配合力差异极显著,其中特殊配合力效应值最高的是G70×湄潭大蛮烟、为29.80,最低的是红花大金元×湄潭大蛮烟、为-40.05。表明烟草烟碱含量性状改良的遗传资源丰富,在烤烟育种中引入其他烟草类型的优良性状,同时筛选烟叶烟碱含量符合生产需求的烤烟新品种是可行的。     

降低烟草工业废弃物中烟碱含量的研究

为探讨烟草工业废弃物的合理处置方式,以工业产生的废烟丝、废烟末为样品。对比分析不同处理方式(紫外光照射、不同p H的Ca(OH)₂溶液浸泡、超纯水浸泡)对样品内烟碱含量的影响。研究发现,采用紫外光照射40 min后,样品内烟碱含量并未降低;而不同PH的Ca(OH)₂溶液浸泡以及超纯水浸泡均可使样品内烟碱含量下降96%以上。对废液的研究表明,超纯水浸泡以及pH=8的Ca(OH)₂溶液浸泡后废液中烟碱含量分别为110,45.73 mg·100 mL^-1。本试验表明,溶液浸泡处理可有效降低烟草废弃物中的烟碱含量,降低幅度受溶液pH影响较小,但浸泡后废液中烟碱含量残留较多,需进一步处理。本研究为烟草工业废弃物的处置提供了参考。     

烟草中游离态烟碱的测定

用有机溶剂萃取烟草中的游离态烟碱,考查溶剂、萃取方式、料液比、提取时间、提取温度和振荡速度等对游离烟碱得率的影响。结果表明,料液比为1：30时,三氯甲烷为萃取溶剂,在40℃条件下提取30 min,摇床转速为200 r/min时,提取效果最好。     

影响烟草中烟碱含量的因素及调控措施

综述了烟碱在烟株体内的积累与分布规律,分析了影响其含量的遗传特性、生态因素和栽培措施,提出了相应的烟碱调控措施。     

水热耦合效应对烟叶中烟碱含量的影响

通过室内模拟试验,研究了水分和温度以及水热耦合对烟叶中烟碱含量的影响。结果表明,烟叶中烟碱含量受土壤含水率的影响,在各供试温度下,当土壤含水率为14%～18%时,不同生长期烟叶烟碱含量均随土壤含水率的增加而增加;土壤含水率为20%～25%时,则随之增加而减少;土壤淹水不利于烟碱的合成积累。土壤温度对烟叶中烟碱含量的影响程度大于水分,增温有利于烟碱的合成积累,当温度在15～30℃时,烟碱含量随温度升高而增加。水热耦合对烟叶烟碱含量的影响呈正交互效应,在适宜烟碱合成积累的水热条件下,水热耦合有利于提高烟碱含量;在不利于烟碱合成积累的条件下,水热仍可通过互补耦合提高烟叶烟碱含量。     

云南烤烟烟碱含量特点

采用连续流动法检测分析了云南烟区B2F、C3F、X2F 3个部位6 948份烤烟样品烟碱含量特点.结果表明:云南烤烟烟碱含量均值及其主要分布范围较适宜,上、中、下3个部位烟叶烟碱含量分别为3.26％、2.44％、1.75％.烟碱含量的主要分布范围为上部叶2.0％～4.0％、中部叶1.5％～3.5％、下部叶1.0％～2....     

不同根系调节剂对烟草烟碱及钾素分布的动态影响

采用盆栽试验,研究了ＡＢＴ４,ＦＡ及ＦｅＳＯ４ ３种营养调节剂对烟草根系活力、烟碱合成、Ｋ素吸收与分布的影响,结果表明,烟草根系活力的动态变化呈双峰曲线,根系及叶片的烟碱含量与根系活力的趋势相同,即在移栽后３０ｄ有一高峰,然后缓慢下降,到移栽后７０ｄ又开始上升,烟草根、茎、叶中Ｋ素含量的变化趋势一致,在整个生育期内均呈下降趋势,调根剂ＡＢＴ４,ＦＡ,ＦｅＳＯ４对根系活力、Ｋ素吸收和烟碱合成均有促进     

烤烟烟碱含量与烟叶物理性状的关联分析

【目的】探讨烟叶物理性状对烟碱含量的影响效果及主次关系,为构建烟碱调控技术体系提供关键的物理性状选择指标。【方法】在我国南北7个主产烟省的12个县,统一栽培品种及栽培措施,采用逐步回归、通径分析和灰色关联度分析方法,对烤烟烟碱含量与物理性状进行关联分析。【结果】单叶重与烟碱含量关系最密切,其次是单叶面积和叶面密度,含梗率和长宽比与烟碱含量的关联度则较小。单叶重和叶面密度与烟碱含量呈极显著正相关,单叶面积对烟碱含量作负效应贡献。【结论】烟草栽培实践中,应根据烟碱的调控目标,确定适宜的单叶重和单叶面积范围,同时也要兼顾各物理性状的协调发展,达到优质适产的目的。     

斑节对虾UBE2H基因克隆及其表达

【目的】克隆斑节对虾(Penaeusmonodon)泛素结合酶E2 H基因(UBE2H),了解其组织特异性表达情况,为揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用提供依据。【方法】PCR扩增斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框,利用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾各组织及不同发育期斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达情况;并构建pET32a-UBE2H原核表达重组质粒,进行诱导表达及蛋白纯化。【结果】克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp (GenBank登录号KU870456),其中,5'非编码区77 bp,3'非编码区378 bp,开放阅读框555 bp(编码184个氨基酸)。斑节对虾UBE2H蛋白等电点(pI)4.88,分子量20.85 kD。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种相似度很高,为78.00%~83.00%。实时荧光定量PCR检测结果显示,UBE2H基因在斑节对虾淋巴组织中表达量最高,其次为鳃;在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺和卵巢中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势,但其峰值出现时间存在差异,肝胰腺的最高表达量出现在卵巢III期,卵巢的最高表达量出现在卵巢II期。经原核表达获得的斑节对虾UBE2H融合蛋白约39.00 kD,纯化后的蛋白浓度为2.92μg/μL。【结论】斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程,与斑节对虾的卵巢发育密切相关。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

罗非鱼感染链球菌后hsp70基因表达研究

采用实时荧光定量RT—PCR检测吉富罗非鱼感染链球菌后脑和脾脏中热休克蛋白70（hsp70）基因表达情况,并按2^-△△CT方法、使用7500 Software v2．0．1进行分析。结果表明,罗非鱼感染链球菌48h内,hsp70mRNA在脑组织表达变化不明显,而在脾脏中表达升高,攻毒感染24h后hsp70mRNA表达量是正常脾脏组织的5．5倍多,说明hsp70在罗非鱼链球菌感染的免疫反应中具有重要作用。研究结果为进一步分析hsp70在罗非鱼感染链球菌过程中所行使的功能奠定基础。     

蜈蚣藻多糖对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响

[目的]研究蜈蚣藻多糖对凡纳滨对虾免疫相关基因表达的影响,为今后将蜈蚣藻多糖开发成凡纳滨对虾免疫增强剂提供理论依据.[方法]将试验凡纳滨对虾随机分为4组,其中A组（对照组）对虾投喂基础饵料,B、C、D组对虾分别喂食含有0.1％、0.2％和0.3％蜈蚣藻多糖的药饵,饲养15d后采用实时定量PCR对各组凡纳滨对虾的肝胰腺组织真核细胞翻译起始因子5A、巨噬细胞移动抑制因子、血蓝蛋白、酚氧化酶原、C凝集素、溶菌酶、热休克蛋白70等7个免疫相关基因的表达水平进行检测.[结果]投喂基础饵料和投喂蜈蚣藻多糖药饵的凡纳滨对虾在外表和行为上无明显差别,且均未出现对虾死亡现象.与A组相比,B、C、D组对虾肝胰腺组织中血蓝蛋白、酚氧化酶原、热休克蛋白70等3个基因的表达量明显升高,且均表现为D组＞C组＞B组＞A组;而真核细胞翻译起始因子5A、巨噬细胞移动抑制因子、C凝集素、溶菌酶等4个基因的表达量无明显变化.[结论]蜈蚣藻多糖可影响凡纳滨对虾的非特异性免疫功能,今后可将蜈蚣藻多糖用于对虾病害防治,以减少化学药物的使用.     

烤烟成熟期淀粉代谢关键酶活性与基因表达研究

【目的】探讨烤烟成熟期淀粉积累状况与淀粉代谢关键酶活性及其基因表达的关系,明确烤烟成熟期淀粉代谢的分子调控机制,为优质烟叶生产提供理论依据。【方法】以不同淀粉积累型烤烟品种秦烟96和豫烟6号为材料,测定成熟期烟叶淀粉含量及比例(直链淀粉、支链淀粉)和淀粉代谢关键酶活性,并对其关键酶基因(NtAGPase、NtGBSSⅠ、NtSSS、NtSBE、NtDBE、Ntα-amylase和Ntβ-amylase)进行实时荧光定量PCR分析。【结果】在烤烟发育成熟期,烟叶淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量呈先升高后降低的变化趋势,烟叶生理成熟期(移栽后85 d)其含量最高;随着烟叶的成熟,烟叶中支链淀粉所占比例逐渐增加。烤烟成熟期AGPase、GBSSⅠ、SSS、SBE和DBE活性呈先升高后降低的变化趋势,而烟叶淀粉酶活性则随着烟叶的成熟先降低后升高,烟叶过熟时其活性显著升高;与烟叶淀粉代谢关键酶活性变化趋势不同,其相关基因表达量变化差异较大。烟叶打顶至适熟阶段,AGPase和GBSSⅠ活性与烟叶直链淀粉含量相关性显著,对烟叶直链淀粉的积累贡献最大,NtGBSSⅠ对直链淀粉代谢起主要调控作用;SSS、SBE和DBE活性对烟叶支链淀粉积累起重要作用,NtSBE和NtDBE对烟叶支链淀粉代谢起主要调控作用。当烟叶由适熟至过熟时,淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)主要参与烟叶的淀粉代谢活动。同一生态环境和栽培条件下,秦烟96淀粉积累较多,具有较高的支链淀粉比例。【结论】烤烟碳水化合物积累以淀粉为主,AGPase和GBSSⅠ是影响直链淀粉积累的关键酶,SSS、SBE和DBE对支链淀粉积累有重要作用,SBE和DBE活性的差异可能是造成烟叶直链淀粉与支链淀粉比值不同的重要原因。     

不同烤烟品种（系）二萜类物质合成关键基因的表达及代谢差异

【目的】探究不同烤烟品种(系)二萜类物质代谢特点,为高香气烟草品种的选育提供理论依据。【方法】选取8306、红花大金元、云烟87、K326、豫烟11、豫烟12共计6个烤烟品种(系),通过q-PCR技术对二萜类物质合成关键基因DXR、CYC-1、CYP71D16、CPS2、ABS进行检测,应用GC-MS技术对二萜类物质及调制后二萜类降解产物进行测定,并对其感官质量进行评价。【结果】DXR、CYC-1和CYP71D16在8306和豫烟11中高表达,CPS2仅在产生顺-冷杉醇品种(系)8306和豫烟11中高表达,ABS在不产生顺-冷杉醇的品种K326、红花大金元、云烟87和豫烟12中高表达。在产生顺-冷杉醇品种(系)中CPS2基因第二外显子第456位碱基表现为G,在不产生顺-冷杉醇品种(系)中碱基表现为T。8306和豫烟11具有较高的西柏三烯二醇含量,顺-冷杉醇和赖百当烯二醇仅在8306、豫烟11中检测出。调制后,8306和豫烟11的西柏烷类降解产物含量较高,各品种(系)均未检测出赖百当类降解产物。豫烟11的感官质量评分最高,表现为香气质和柔细度稍好、浓度稍浓、刺激性稍小、灰色较白。二萜类物质总量与香气量、柔细度、杂气、刺激性和感官质量评价总分呈极显著正相关;二萜类降解产物总量与香气质呈极显著正相关。【结论】不同烤烟品种(系)二萜类物质及其降解产物、基因表达量存在明显差异。8306和豫烟11西柏烷类化合物含量较高的主要原因是,DXR和CYC-1、CYP71D16的上调表达。部分品种不产生顺-冷杉醇与CPS2碱基突变表达受阻有关。结合感官质量评价结果认为,二萜类物质及其降解产物能够起到增添香味、柔和烟气的作用。