猪Ⅲ型干扰素原核表达及其抗病毒效果研究

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P<0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P<0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。     

猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

利用RT-PCR技术从有丝分裂原刀豆素(ConA)诱导的长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因(mPolFN-γ),并将其亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-mPoIFN-γ.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAG...     

猪α干扰素原核表达载体的构建及表达

以重组克隆质粒pGEM-T-IFN-αZ为模板,PCR扩增杂种猪α干扰素,将其插入原核表达载体pET-43.1a-c( )中,构建了猪α干扰素原核表达载体pET-IFN-α,实现了猪α干扰素在大肠杆菌BL21中的表达.SDS-PAGE电泳、Western-blotting检测均出现了特异性的条带.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白以可溶性形式存在.经薄层扫描分析,表达产物约占菌体总蛋白的29.8%.     

猪α-干扰素的原核表达

重组质粒pMDIFN-α中的猪α-干扰素基因经双酶切,亚克隆到原核表达载体pET-．28a,构建了重组表达质粒pETIFN-α,经过SDS-PAGE蛋白质电泳,测得表达蛋白的相对分子质量约为26500．表达蛋白的Western-blotting分析显示：改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、特异性强、重复性好;获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性．     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

在人类文明发展中,人与自然的关系经历了人类对自然的顺从、依附到人类对自然的主宰。工业文明时期,人与自然的关系是对立的,人类把自然看成是掠夺的对象,致使生态危机日益严重。生态文明蕴含着人与自然和谐统一的关系。它承认自然具有内在价值,它以生态科技作为物质基础,实行生态化的生产方式和消费方式。     

重组猪 α干扰素工程菌的诱导表达及产物纯化

为获得大量猪α干扰素的重组蛋白,研究了其发酵条件,并对目的蛋白进行分离纯化。考察了不同IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L)、不同诱导温度(17、27、32、37℃)、不同诱导时间(0、2、3、4、5、6、7、8 h)对目的蛋白表达的影响;同时对包涵体进行提取、溶解变性进行研究,最后采用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。采用SDS-PAGE电泳及Image Pro Plus 6.0软件分析电泳结果,结果显示,IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为27℃、诱导时间为6 h时,目的蛋白表达量最多;超声波破碎细菌的最优时长循环为10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵体过夜可得到大量可溶性目的蛋白含量,Ni柱亲和层析后可去除大量杂蛋白,获得较纯的目的蛋白。可见本试验通过优化重组猪α干扰素诱导表达条件及纯化方法,获得了高表达、高纯度的重组猪α干扰素蛋白,为今后研究其生物活性奠定了初步基础。     

Ⅲ型干扰素及其抗猪病毒性疾病研究进展

综述了Ⅲ型干扰素抗猪易感病毒研究进展,总结了Ⅲ型干扰素抗病毒机制及作为安全性抗病毒药物的优势,探讨了Ⅲ型干扰素及其抗猪病毒性疾病研究现状,重点阐述了Ⅲ型干扰素抗猪易感病毒作用及其防治猪病毒性疾病的相关应用和流行性猪易感病毒对Ⅲ型干扰素的免疫逃逸策略,分析了目前Ⅲ型干扰素未得到广泛应用的问题并提出了建议,展望了Ⅲ型干扰素作为安全性抗病毒药物的应用潜力及前景,以期为猪病毒性疾病的治疗提供理论依据及新思路。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,克隆并表达了猪IFN-γ基因。首先应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,分别将其定向插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-32 a中,经测序表明与已报道的核苷酸序列同源性为100%。接着将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在,分子量分别为43.0和35.0 ku,与理论推算值相符。为研究IFN-γ在表达中结构的变化,采用上述2种融合蛋白分别作为免疫抗原和检测抗原。结果用GST-poIFN-γ免疫小鼠所诱导的抗体可与poIFN-γ产生特异性结合,表明不同原核质粒表达的猪IFN-γ仍保持其特有的结构。     

猪IgG1-Fc基因的克隆、原核表达及表达条件优化

为了探索猪IgG1-Fc(pIgG1-Fc)基因在大肠杆菌中的高效表达,首先通过反转录PCR(RT-PCR)扩增pIgG1-Fc基因,并构建重组表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,然后通过优化异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、菌体培养温度及菌体培养时间,实现pIgG1-Fc重组蛋白的高效表达。结果表明,成功克隆了pIgG1-Fc的基因666 bp,共编码222个氨基酸;重组原核表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc经过酶切和测序证明构建正确,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达,表达的融合蛋白分子量约为36 ku。其最佳表达条件如下:在25℃条件下加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导6 h可形成大量包涵体蛋白。pIgG1-Fc基因被成功克隆并原核表达,为进一步研究该蛋白的功能及实现其他蛋白与pIgG1-Fc融合后原核表达奠定了基础,为制备能与猪IgG1结合的二抗提供了材料。     

猪α干扰素基因的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

将猪IFN-α(poIFN-α)成熟蛋白基因克隆于pET-28a载体中,转染大肠杆菌,并进行诱导表达.经SDS-PAGE检测,融合表达的蛋白poIFN-α大小约27ku.收获融合表达的poIFN-α,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA方法对融合细胞进行检测,结果获得了1株能稳定分泌抗poIFN-α蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H12株.Western-blotting结果及单克隆抗体亚型鉴定结果表明,单抗与重组蛋白发生特异性反应,单抗为IgG1亚型,且轻链为κ链.     

山羊α-干扰素基因克隆、原核表达及其抗病毒活性研究

为研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异及重组α-干扰素的抗病毒活性,采用RT-PCR扩增雷州山羊α-干扰素基因,分析其核苷酸序列;采用PCR方法扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列,构建原核表达载体pET- mIFN-α,并在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达;采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白rG-mIFN-α;通过细胞病变抑制法测定其抗小反刍兽疫病毒（PPRV）和山羊痘病毒（GPV）活性。结果表明,雷州山羊α-干扰素全基因由570个核苷酸组成,编码189个氨基酸;与GenBank 上发表的山羊、林麝、弯角大羚羊、黄牛、瘤牛、绵羊、猪、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%、96.8%、81.6%、77.8%和70.0%;氨基酸序列同源性分别为100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%、93.7%、67.9% 、61.6%和55.3%,提示反刍动物α-干扰素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守;rG-IFNα主要以包涵体形式存在,分子质量约32 ku;重组山羊α-干扰素能显著抑制PPRV和GPV感染引起的细胞病变,其抗PPRV和GPV效价分别为1.6×10⁴ U/mg和1.35×10⁴ U/mg。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

2型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达

本研究克隆、原核表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白。根据新分离毒株PCV2-871的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去掉核定位信号的ORF2基因,命名为pcv-581,利用引入的双酶切位点BamHI/HindⅢ将其连接到表达载体pQE-32中,命名为pQE-pcv581转化大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE鉴定,发现去核定位信号的ORF2片段可以大量表达。     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达和鉴定

[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap.     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其抗原性分析

根据GenBank中登录的PCV-2序列,设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去除核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因,经Bam HI和Xho I双酶切后将其插入到表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,并转化到表达菌株Rossetta(DM3)中,采用IPTG进行诱导表达,采用SDS-PAGE薄层灰度分析表达情况,收集菌体,使用GST-Protein Purification Kit亲和层析纯化方法对表达的GST-Cap融合蛋白蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测纯化效果,Western blot分析纯化后的重组Cap蛋白(rCap)免疫学活性。结果表明,成功克隆了大小为579 bp去除核定位信号的ORF2基因,成功诱导表达出预期大小45.3 ku相一致的rCap蛋白,表达量占总菌体的25%,纯化后的rCap蛋白SDS-PAGE电泳分析纯度达到90%以上,Western blot分析表明纯化的rCap蛋白能与PCV-2阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性。     

猪流行性腹泻病毒N基因的克隆及原核表达

从患猪流行性腹泻的病猪粪便中分离了猪流行性腹泻病毒(PEDV)命名为HLJBY,将病毒在Vero细胞上传代,使之适应生长。将扩增的猪流行性腹泻病毒的N基因克隆到原核表达载体PET30a上,构建了重组表达质粒PET-30a-PEDV-N,并在37℃的条件下诱导表达,通过不同时间取样,经SDS-PAGE分析结果表明,该蛋白...     

重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。