丹顶鹤源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏结果分析

目的 为查明一例源于安徽省动物园的丹顶鹤死因。方法 从该丹顶鹤肝部组织坏死灶采集病料,进行细菌分离与鉴定,并对其药敏结果进行分析。结果 该菌落在血琼脂平板上生长呈白色不透明菌落,革兰氏阴性菌;生理生化试验显示该菌在葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇和硫化氢等中均呈阳性;PCR 扩增其 16S rDNA 基因,其大小约 1500bp,经遗传进化树分析,与已报道的弗氏柠檬酸杆菌NBRC 12681株(NR 114345.1)在同一分支;药敏结果显示其对氧氟沙星和庆大霉素高度敏感,对丁胺卡那、多粘霉素B中敏;对青霉素、阿莫西林、四环素、头孢噻肟、氨苄西林、复方新诺明、氟苯尼考耐药。结论 本次从患病丹顶鹤肺部分离的病原是弗氏柠檬酸杆菌,且对多种抗菌药具有一定的耐药性。为珍稀野生保护动物的相关病原研究和防治提供参考。     

加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】明确引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈（Micropterus salmonoides）体表出血和溃烂的病原菌,并进行药物敏感性分析,为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离病原菌,经革兰氏染色和磷钨酸负染后,使用光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性;通过ATB Expression生化鉴定仪和Biolog微生物自动鉴定系统进行生理生化特性鉴定,基于16S rRNA序列和gyrB基因序列进行分子生物学鉴定,经人工回归感染试验和组织病理学观察进一步确定病原菌的致病性及其对组织细胞的损伤,同时以K-B纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患病加州鲈肝脏中分离获得1株优势菌株（180803bj_jzl）,为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌,Biolog微生物系统自动鉴定其为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）的可能性高达99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树均显示,分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支,与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上,gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。人工回归感染7 d内的累积死亡率达60%,临床症状与自然发病加州鲈的症状基本相同;其肝脏组织中央静脉和肝窦有红细胞淤积,肝细胞质内有大量空泡,呈散在变性坏死;脾脏的白髓与红髓分界不清,脾窦和脾小血管内有嗜铁血红素中心;鳃小片上皮细胞与毛细血管分离,呈球拍状,部分上皮细胞坏死脱落,只残存少量鳃小片骨架。分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星、氧氟沙星、大观霉素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等7种抗菌药物敏感,对多西环素、四环素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、头孢氨苄和阿莫西林等15种抗菌药物已产生耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡,且具有较强的毒力,致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤,实际生产中可选用新霉素和恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。     

一株大凉疣螈肠道弗氏柠檬酸杆菌的分离及其药敏试验

首次从大凉疣螈（Tylototriton taliangensis）肠道分离获得弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）,利用分子生物学方法对其16SrD—NA进行了扩增测序,并与GenBank中已有的有关序列进行比较,进行了系统发育分析．．测序结果表明,16SrDNA与GenBank中序列同源率在98％～99％,分离的菌株与GUl26681（C．freundii MRB0903）处于同一分支中;序列同源性及系统发育树表明,此菌为弗氏柠檬酸杆菌;药敏试验表明,弗氏柠檬酸杆菌对氨苄西林及头孢噻吩中介,对其余药物均敏感。     

大鲵源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及胞外酶活性研究

为了确定重庆武隆大鲵养殖场患病大鲵的病原菌,并进行菌种鉴定及胞外酶活性研究,从具有典型症状的病鲵肝脏分离出一株菌株TNL12,根据形态学特征、生理生化特性及16SrDNA分析对菌株进行种类鉴定,通过人工感染试验确定病原菌株的致病性,利用平板法检测胞外酶活性.结果显示,所获菌株为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,其生理生化特性与弗氏柠檬酸杆菌一致.16SrDNA分析表明,TNL12与弗氏柠檬酸杆菌的同源性为99%,在系统发育树上与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支.该病原菌可引起健康青蛙、大鲵出现感染症状,且感染症状与自然发病症状相似.胞外酶活性检测发现该菌可产卵磷脂酶、淀粉酶,但不产脂酶、蛋白酶、明胶酶、脲酶等胞外酶.这些研究结果表明,从患病大鲵中分离出的病原菌为弗氏柠檬酸杆菌,且对大鲵有较强的致病性.     

中华绒螯蟹致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏特性

[目的]明确中华绒螯蟹黑鳃病的病原菌及其药敏特性,为该病的临床诊断和防控提供科学依据.[方法]采用传统方法从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌,通过人工回归感染试验确定病原菌的致病性,利用API 20E细菌鉴定系统和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定,并以K-B药敏纸片扩散法测定其药敏特性.[结果]从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺中共分离获得4株疑似病原菌株(C1、C2、C3和C4),人工回归感染试验结果表明,仅C1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡,死亡率达90%,且试验中华绒螯蟹出现黑鳃、肝胰腺呈浅黄色的病症,与自然发病的症状基本一致.依据C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析结果,可确定C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),其对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量(LD50)为2.85×105 CFU/mL.药敏试验结果表明,C1菌株对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星和恩诺沙星等9种抗生素高度敏感,对多粘菌素B中度敏感,对氨苄西林、羧苄青霉素和万古霉素3种抗生素已产生耐药性(不敏感).[结论]弗氏柠檬酸杆菌感染可引起中华绒螯蟹黑鳃病,且对中华绒螯蟹具有较强毒力,实际养殖生产中可选用新霉素、多西环素等渔用抗生素进行防治.     

蟹源弗氏柠檬酸杆菌拮抗菌PNB3的分离鉴定与安全性分析

摘 要：筛选和鉴定抗水产致病性弗氏柠檬酸杆菌的优良芽孢杆菌,并分析其安全性。以一株蟹源致病性弗氏柠檬酸杆C1作为筛选指示菌、抑菌圈直径和抑菌效果作为指标进行抗菌芽孢杆菌优良菌株的分离与筛选,综合生理生化鉴定与16S rRNA序列分析对抗菌芽孢杆菌优良菌株进行鉴定,并参照《HJ/T 415—2008 环保用微生物菌剂环境安全评价导则》、《NY/T1444-2007微生物饲料添加剂评价通则》等国家标准,从毒力基因、耐药性、对小球藻生长的影响以及对斑马鱼和中华绒螯蟹的致病性等方面分析抗菌芽孢杆菌优良菌株的安全性。结果显示,从养殖淤泥中分离并筛选出一株抗菌芽孢杆菌优良菌株PNB3,其在1.0×105 CFU/mL时与蟹源致病性弗氏柠檬酸杆菌C1共培养处理120 h的最高抑菌率达到了99.99%。结合生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析,菌株PNB3被鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),不含溶血素BL基因、肠毒素Nhe基因、肠毒素T基因、肠毒素FM 基因、细胞毒素 K 基因、呕吐基因、多效调控因子等毒力基因,对复方新诺明、氨苄西林、诺氟沙星、卡那霉素、多粘菌素B、氟苯尼考、庆大霉素、依诺沙星、头孢拉定、青霉素等10种抗生素高度敏感,对多西环素、四环素等2种抗生素中度敏感,对链霉素耐药,在终浓度为2.0×104~2.0×108 CFU/mL时对小球藻的生长有促进作用,对斑马鱼的半数致死浓度（LC50）大于2.0×108 CFU/mL,对中华绒螯蟹的半数致死浓度（LC50）大于2.0×108 CFU/g。地衣芽孢杆菌PNB3是一株具有潜在安全性的弗氏柠檬酸杆菌拮抗菌,具备应用于中华绒螯蟹弗氏柠檬酸杆菌病生物防控的安全基础。     

克氏原螯虾布氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏分析

从患病的克氏原鳌虾(Procambarus clarkii)中分离纯化得到一株优势菌株AX1707。通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定、16S rRNA基因测序和进化树构建等操作进行分析,结果显示,AX1707为布氏柠檬酸杆菌(Citrobter braakii),人工感染试验结果显示该菌具有较强致病性,药敏试验结果显示其对恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、复方新诺明、庆大霉素和多西环素敏感,对四环素和新霉素中度敏感,对红霉素和氨苄西林耐药。     

巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及组织病理观察

为观察巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及其组织病理学特征,采用人工感染试验、石蜡切片和HE染色方法进行组织病理研究。结果表明,感染发病龟主要表现为眼结膜发炎、口鼻皮肤溃烂,解剖可见肺部发黑,肠道淡黄色,无内容物、水样黏液增多等临床症状;组织病理学观察显示眼睑上皮组织色素细胞增多,胃和肠上皮细胞变性、坏死、脱落,心脏心肌纤维间隙变宽、坏死且有大量炎性细胞浸润,肺脏肺泡细胞与血管内皮细胞界限不清、肺泡壁毛细血管淤血,肝脏肝细胞坏死、中央静脉淤血、肝细胞索紊乱,肾脏肾小管上皮细胞坏死,肾小球出血,肌肉肌纤维间隙有大量炎性细胞浸润。以上结果为阐明龟类弗氏柠檬酸杆菌病的致病机理提供一定参考。     

中华鳖3个选育群体的生长对比

为评估中华鳖（Pelodiscus sinensis）黄河群体、洞庭群体及其杂交选育群体绿卡鳖（洞庭♀×黄河♂的杂交子代经过5代群体选育所得）的生长性能,对露天池塘养殖条件下3个选育群体进行了连续观测对比试验遥试验时间为2012年8月1日到2014年4 月15日。除越冬期外,每30d左右记录3个群体的生长数据。结果显示：（1）在生长速度方面,表现为黄河鳖跃绿卡鳖跃洞庭鳖：（2）在整齐度方面,稚鳖期绿卡鳖的整齐度最好,幼鳖期表现为洞庭鳖＞绿卡鳖＞黄河鳖：（3）三者的裙边比无明显差异：（4）饲料利用率表现为洞庭鳖＞绿卡鳖＞黄河鳖,存活率表现为洞庭鳖＞绿卡鳖＞黄河鳖。综合可见绿卡鳖具有明显的优势,应予以推广。     

MicroRNA-499对中华鳖脂类代谢相关基因表达的影响

采用体内注射microRNA-499特异性抑制剂antagomirs的方法,揭示microRNA-499对中华鳖脂类代谢相关基因的调控作用。选取健康稚鳖15只,随机分成3组,分别设为空白对照组、注射生理盐水组和注射miR-499 antagomirs组。在同一时间点连续注射3 d后,测定中华鳖血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇含量,采用实时荧光定量PCR测定肝脏中microRNA-499和脂类代谢相关基因表达水平。结果表明,相对于空白对照组和注射生理盐水组,注射miR-499 antagomirs导致中华鳖肝脏甲状腺激素应答蛋白(THRSP)和钠/碘共同转运体(NIS)的表达水平升高,肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)表达水平降低(P<0.05)。microRNA-499影响中华鳖脂类代谢相关基因的表达水平,这可能与中华鳖脂肪生成和脂肪酸β-氧化有关。     

不同雌雄配比对中华鳖人工繁殖受精率的影响

研究了中华鳖(Pelodiscus sinensis)人工繁殖不同雌雄配比的受精率差异,结果显示:在放养密度3750~4500 kg/hm2,亲鳖规格♀1.5 kg/只、♂2.0 kg/只条件下,雌雄配比可达8∶1。在不增加水体面积和投资情况下,雌雄比8∶1与5∶1相比多产受精卵13500~18000枚/hm2,可增加纯利润27000~30000元/hm2。     

有益微生物对中华鳖养殖池塘水质及细菌数量的影响

[目的]研究枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌及二者等比例混合剂的应用对中华鳖养殖池塘水质及总异养细菌数量的影响.[方法]在试验池塘分别施用1 mg/L枯草芽孢杆菌、1 mg/L植物乳杆菌,枯草芽孢杆菌(0.5 mg/L)和植物乳杆菌(0.5 mg/L)的混合剂,研究其对中华鳖养殖池塘水体的亚硝酸盐含量、氨氮含量、溶解氧含量、pH及总异养细菌数量的影响.[结果]施用这些有益微生物对养殖水体的溶解氧及pH没有明显影响.混合剂对养殖水体的氨氮及亚硝酸盐的去除效果最为明显,氨氮及亚硝酸盐含量分别降低42.37％和45.56％.其次为枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌,可使水体中的氨氮及亚硝酸盐含量分别降低34.60％、31.63％和14.54％、15.59％.混合剂、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌添加组和对照组的总异养细菌数量分别为3.02×105、3.09×105、3.13 × 105、3.45 × 105 cfu/ml,各试验组无显著差异(P＜0.05).[结论]使用混合剂不仅能有效地改良水质,而且水体总异养细菌数量最少.     

中华鳖人工繁殖不同雌雄配比对孵化率的影响研究

采用雌雄配比(5～8)∶1,不同配比亲鳖所产受精卵在相同孵化条件下,孵化率无显著性差异(P>0.05)。孵化率高低只与孵化环境因子有密切关系,与性别比无关。     

急性冷应激对中华鳖幼鳖Vc合成能力和组织Vc含量的影响

以中华鳖幼鳖为研究对象,研究了急性冷应激对中华鳖幼鳖内源Vc合成能力和不同组织Vc含量的影响。在水温(29±1)℃条件下,用不添加Vc的基础饲料对中华鳖幼鳖(体重(206.31±28.33)g)进行投喂,驯化3周后开始急性冷应激试验,应激条件为(13±0.7)℃,6 h。结果表明,幼鳖在急性冷应激6 h后GLO活力较冷应激前有所升高,但未达到显著水平(P0.05)。冷应激前后肝脏组织Vc含量与脑组织Vc含量均未发生显著变化。此外,雌性幼鳖与雄性幼鳖的GLO活力存在较大差异,但由于样本量偏少,尚不能断定是否确实存在这种性别差异。急性冷应激对幼鳖的Vc合成能力具有一定的促进作用,对肝脏组织Vc含量与脑组织Vc含量没有显著影响。     

中华鳖对嗜水气单胞菌粗脂多糖(LPS)的免疫应答

将采用温酚法从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)中提取的粗脂多糖(crude lipopolysaccharide,LPS)作为免疫原,注射接种中华鳖(Pelodiscus sinensis)后,通过测定受免鳖的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和对A.hydrophila活菌细胞内杀菌活性,比较了3种致病菌的粗LPS对中华鳖的免疫原性。试验结果表明,从3种致病菌中提取的粗LPS对中华鳖均具有较强的免疫原性,受免鳖的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鳖相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hydrophila活菌杀菌活性明显上升。说明在3种供试菌的粗LPS上不同程度地存在3种致病菌的共同保护性抗原。     

竹鼠多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

[目的]分离、鉴定竹鼠多杀性巴氏杆菌并探讨其对药物的敏感性。[方法]从红河州某竹鼠养殖场采集患病竹鼠病灶进行了细菌的分离培养,并对分离的菌株进行了生化鉴定、动物回归试验及药敏试验。[结果]分离的病原体为多杀性巴氏杆菌,该菌株对青霉素、诺氟沙星、阿米卡星等敏感,而对链霉素、红霉素、庆大霉素、氯霉素等耐药。[结论]为多杀性巴氏杆菌的治疗与诊断提供了参考。     

中华鳖肠道及其养殖水体菌群比较

为了解养殖水体环境对中华鳖的影响,通过平板计数及细菌的分离鉴定,对健康鳖肠道、患病鳖肠道以及其养殖水体中菌群的数量、种类等进行比较分析。研究显示,病鳖肠道菌群总量(1.21×105)~(4.9×107)cfu·g-1,明显高于健康鳖的(3.2×104)~(7.13×105)cfu·g-1,且菌群种类较健康鳖多样;健康鳖肠道优势菌为肠球菌与柠檬酸杆菌,患病鳖肠道优势菌为柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、气单胞菌;养殖水体中分离到的细菌均在病鳖肠道内分离到,从一定程度上反映了养殖环境对其肠道菌群的重要影响。