磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因过量表达对集胞藻PCC6803脂肪酸合成的影响

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheinyl transferases,PPTase）是细菌脂肪酸合成中的关键酶。本研究利用同源重组手段构建集胞藻PPTase基因（slr0495）过量表达重组质粒,在集胞藻PCC6803中进行表达研究,并在DNA和RNA水平进行验证,利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测不同条件下突变藻株脂肪酸组分及含量。结果表明：在温度为30 ℃、光照强度为50 μmol ·m^-2 · s^-1培养条件下,过量表达slr0495基因突变藻株中C12:0、C16:0和C18:0的含量分别为1. 31 mg · g^-1、8.07 mg · g^-1和1.35 mg · g^-1,比野生型藻株分别提高了23.58%、25.31%和13.45%;在温度为20 ℃、50% NaNO₃浓度、光照强度为50 μmol · m^-2 · s^-1培养条件下,与野生型相比,突变藻株中C16:0和C18:0含量分别提高了44.71%和41.51%。以上结果表明,过表达slr0495基因增加了集胞藻PCC6803中长链饱和脂肪酸的含量,并且在低温（20 ℃）和缺氮（50% NaNO₃）双重胁迫培养条件下中长链饱和脂肪酸含量得到进一步提高。本研究为探究slr0495基因功能以及在逆境中基因产生的应激反应提供了理论依据,为微藻高产多不饱和脂肪酸代谢研究奠定了基础。     

集胞藻PCC6803蛋白组学研究进展

自集胞藻PCC6803蛋白组学研究工作开展以来,已取得一系列研究成果。这些研究成果主要分为2类：①鉴定了全细胞或亚细胞结构内表达的蛋白质;②发现了许多环境胁迫条件引起的蛋白质差异表达,为理解细胞胁迫反应和蛋白的功能提供了线索。从这2个方面分别对集胞藻PCC6803蛋白组学的研究成果进行简要综述。     

集胞藻6803藻胆体藻蓝蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

通过PCR扩增出集胞藻6803 C-PC编码基因cpcA,构建表达质粒pET32a(+)-cpcA,转化大肠菌株BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导表达、经His-tag纯化后免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体。间接ELISA法揭示该抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性。应用该抗体进行蛋白免疫印迹检测,结果发现C-PC蛋白在生长光与高光培养条件下的数量,以及与2个光系统间的连结数量均存在显著差异,为进一步研究藻胆体的杆在响应与适应机制中所承担的重要角色奠定了生化基础。     

用同源重组法将Δ5 Des整合在集胞藻6803中的表达

从枯草芽孢杆菌染色体中扩增出受冷诱导的Δ5Des去饱和酶,构建出可以与集胞藻PCC6803染色体发生同源双交换的质粒,将Km抗性基因::PpsbA1::Δ5脂肪酸去饱和酶基因和对照基因分别整合入PCC6803的染色体上,获得转化子后,对不饱和脂肪酸进行研究。结果发现,30℃条件下脂肪酸成分的含量发生了较大变化,20℃时有新成分的出现,且长链脂肪酸的含量有所上升。     

集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脱羧酶的原核表达分析

【目的】α-酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD)是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。     

氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803细胞中羧酶体数目及其相关蛋白丰度的影响

羧酶体是由致密的外壳蛋白包裹着核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶和碳酸苷酶形成的细胞内蛋白质小体,是蓝细菌二氧化碳固定的场所。为解析羧酶体在不同培养条件下的功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有组氨酸标签的CcmK2重组蛋白,制备了其多克隆抗体,探讨了不同质量浓度氯霉素对细胞内羧酶体数目和羧酶体相关蛋白丰度的影响。首先,确定了不同质量浓度的氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803生长的影响,发现5.0μg/mL氯霉素能够完全抑制菌株的生长,但是可以维持菌株存活。随后,探讨了集胞蓝细菌在葡萄糖异养和光合自养转换过程中,氯霉素对细胞内羧酶体数目及羧酶体相关蛋白的影响。结果显示:氯霉素的加入抑制了细胞内羧酶体数目对环境碳源的响应;同时,Western blot检测发现5.0μg/mL氯霉素能够抑制细胞内新的羧酶体外壳蛋白CcmK2的合成。这些结果表明,氯霉素可能通过抑制羧酶体外壳蛋白的合成来干扰细胞内羧酶体的形成,细胞内羧酶体对环境碳源的响应存在复杂的调控机制。     

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

利用同源重组构建蓝藻集胞藻6803ndhM基因突变株及其分子鉴定

蓝藻NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO2吸收、围绕光系统I的循环电子传递和细胞呼吸。迄今为止,人们已在蓝藻细胞中鉴定出15种NDH-1复合体亚基(NdhA-NdhO)。然而,人们对NdhM亚基的研究尚不够,至今未见有反向遗传学等方面的研究。在通过构建同源重组载体、自然转化和多次继代筛选后,对转化子进行了PCR和蛋白免疫印迹鉴定。研究结果表明,壮观霉素基因已成功地插入到ndhM基因的保守区域,并完全破坏了ndhM基因的蛋白表达,从而获得了ndhM基因缺失的突变株,为进一步研究NdhM亚基对NDH-1复合体的稳定性和生理功能等奠定了试验基础。     

集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2蛋白多克隆抗体的制备与检测

CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反应;最后,通过Western blot分析证实该多克隆抗体能够特异而灵敏地检测集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2的丰度。     

光生物反应器中集胞藻6803的光衰减及其生长动力学研究

[目的]分析集胞藻6803细胞培养体系的光衰减及分批培养条件下藻细胞的生长特性。[方法]以集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）为供试藻种,用尤尼柯7200型分光光度计测定藻细胞浓度和用ST-85自动量程照度计测定光强在通过不同光程、不同浓度藻液时的变化。[结果]随着藻细胞浓度和光程的增加,光强迅速下降。在同一光程下,光强随着藻细胞浓度的增加而下降。在培养初期藻细胞浓度较低时,光衰减程度较小;在培养后期,随着藻细胞浓度的增加,光衰减程度逐渐增加。在培养过程中藻体细胞的生长规律与微生物发酵过程中菌体的生长规律相似。藻体细胞生物量曲线与微生物发酵时的菌体生长曲线相似。[结论]Lambert-Beer公式Ln（I/I0）=-KaXL能较好描述藻细胞浓度和光程对光衰减的综合影响;Logistic方程能很好描述藻细胞的生长曲线。     

富硒益生菌对山羊瘤胃发酵和瘤胃液脂肪酸含量的影响

为研究日粮中添加富硒益生菌(SP)对山羊瘤胃发酵和瘤胃液脂肪酸含量变化的影响,以8头装有永久性瘘管的山羊为对象,采用4×4拉丁方设计,进行4期试验,每期15 d。日粮中分别添加0(对照)、8(LSP)、16(MSP)和32(HSP)mL.d-1的SP。结果表明:日粮添加SP能显著影响山羊瘤胃pH值(P<0.01)、总挥发性脂肪酸(P<0.05)、微生物蛋白(P<0.05)和trans11-C18∶1浓度(P<0.05);并有升高瘤胃乙酸比例(P=0.08)、α-C18∶3浓度(P=0.07)以及降低瘤胃丁酸比例(P=0.05)、氨氮浓度(P=0.08)的趋势。说明日粮添加SP对缓解瘤胃pH值的下降,促进瘤胃总挥发性脂肪酸的产生、微生物蛋白的合成和对氨氮的利用,以及提高瘤胃液α-C18∶3和共轭亚油酸前体trans11-C18∶1的含量有积极作用。     

活化卵白蛋白对断奶仔猪结肠内SCFA的影响

为了研究活化卵白蛋白对断奶仔猪结肠内短链脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)的影响,选取54头20日龄健康仔猪,随机分为3个处理组。23日龄开始,Ⅰ组饲喂基础日粮+活化卵白蛋白10 mL·d-1·头-1,Ⅱ组饲喂基础日粮+啤酒酵母10 mL·d-1·头-1,Ⅲ组连续饲喂基础日粮10 d,28日龄断奶。仔猪在23,28,35,42日龄时,从每个重复中随机选1头屠宰,迅速结扎结肠两端,无菌收集结肠食糜,利用气相色谱法测定结肠内SCFA含量。试验结果表明: (1)仔猪28日龄时,与Ⅲ组相比,Ⅰ组仔猪结肠内乙酸(P＜001)、丙酸(P＜005)、丁酸(P＜005)和总SCFA(P＜001)含量升高,而异丁酸(P＜001)含量降低;与Ⅱ组相比,Ⅰ组仔猪结肠内乙酸(P＜001)、异丁酸(P＜001)和总SCFA(P＜001)含量升高;(2)仔猪42日龄时,与Ⅱ组、Ⅲ组相比,Ⅰ组仔猪结肠内乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和总SCFA含量显著升高(P＜005);(3)随着仔猪日龄的增加,各组仔猪结肠内总SCFA含量均增加,但Ⅰ组增加最明显。由此看来,活化卵白蛋白可以提高断奶仔猪结肠内SCFA含量。     

不同脂肪酸种类及浓度对棉纤维分化发育的影响

以陆地棉标准系 TM‐1为材料,利用棉花胚珠离体培养技术并结合对纤维分化发育状态的扫描电镜观察,研究豆蔻酸(C14)、棕榈酸( C16)、硬脂酸( C18)、油酸( C18：1)、亚油酸( C18：2)、花生酸( C20)、山嵛酸( C22)、木蜡酸(C24)等不同链长脂肪酸以及不同浓度棕榈酸对棉纤维分化发育的影响.结果表明：在离体培养基中添加棕榈酸( C16)对棉纤维的分化发育及伸长有较明显的促进作用,特别是在培养基中添加5.0μmol/L 棕榈酸纤维的伸长最明显,其纤维平均长度为1.086 mm ,比对照增加53.4％,差异具统计学意义( P＜0.01),而棕榈酸浓度过高则抑制纤维的伸长;木蜡酸( C24)对纤维伸长也表现出一定的促进作用,纤维平均长度比对照增加21.9％( P ＜0.05);扫描电镜观察表明,在5.0μmol/L 棕榈酸处理下胚珠表面光滑且突起多、密,分布均匀;添加硬脂酸、油酸或山嵛酸的处理几乎没有出现突起.说明在本试验条件下,在棉花胚珠离体培养中促进纤维分化发育的棕榈酸适宜浓度为5.0μmol/L .     

不同强化剂和强化时间对糠虾脂肪酸组成的影响

分别用鸡蛋黄(对照组)、三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum、强化剂1和强化剂2对糠虾Neomysis sp.进行脂肪酸营养强化,测定了糠虾在强化前和强化4、8、12 h的脂肪酸组成.结果表明,不同强化剂对糠虾的脂肪酸强化效果差异明显.强化前,糠虾的主要脂肪酸为16: 0、18: 1n-9、22: 6n-3(DHA)和20: 5n-3(EPA).对照组糠虾的EPA、DHA和多不饱和脂肪酸(PUFA)均在0 h最高,分别为15.727%、17.072%、45.850%;微藻组糠虾的花生四烯酸20: 4n-6(AA)和PUFA含量在强化4 h达到最高,分别为0.615%和49.421%,EPA和DHA在强化12 h最高,分别为18.138%、17.896%;强化剂1组AA、EPA、DHA和 PUFA均在强化8 h达到最高值,分别为0.695%、16.868%、19.771%和50.603%;强化剂2组糠虾的AA含量和PUFA含量在4 h达到最高,分别为0.693%和49.938%,EPA和DHA在8 h最高,分别为16.500%和18.664%,各组在强化过程中饱和脂肪酸(SFA)含量均无显著性变化.对强化后的糠虾进行饥饿处理,结果表明,随着饥饿时间的延长,糠虾体内SFA的含量逐渐下降,而PUFA的含量逐渐上升,表明在饥饿过程中糠虾优先动用体内的饱和脂肪酸.     

盐胁迫下钙对草莓叶片脂肪酸含量及组成的影响

在盆栽条件下用150mmol/LNaCl溶液处理达塞莱克特草莓植株,研究了10mmol/LCaCl2对叶片膜脂脂肪酸含量的影响。结果表明,在盐胁迫5d时,缺钙和钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)处理减少不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、棕榈烯酸和亚麻酸)的积累量,阻碍棕榈酸和硬脂酸的脱饱和反应,抑制膜脂不饱和度的增加;而加钙处理的变化趋势与此相反,表明钙提高植株的耐盐性。在不饱和脂肪酸中亚油酸含量最高,缓解盐害的效应大于其他脂肪酸。