弹状病毒基质蛋白(Matrix protein)的研究进展

弹状病毒的基因组由1段线性单股不分节的负链RNA组成,主要编码5个结构蛋白,分别为核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Mattix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)和RNA聚合酶(RNA polymerase,L).其中,基质蛋白(...     

南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子

 【目的】分析南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）基因组S6编码的SP6蛋白的抑制子活性,明确SRBSDV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物的沉默。【方法】将分别含有SP6与GFP质粒的农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟纯合系,观察SP6对局部沉默和系统沉默的抑制作用;将含有SP6,GFP和dsGFP质粒的农杆菌三者共浸润,观察SP6对由dsRNA引起的沉默的抑制作用;在同一植株不同部位接种GFP和SP6,观察SP6对RNA沉默信号传导的影响;通过马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）在本氏烟上表达SP6,观察SP6是否能增强PVX的致病性。【结果】SP6能抑制由GFP正义RNA介导的沉默,但其抑制作用较弱,仅能延缓局部沉默和系统沉默的产生。SP6能灭活RNA沉默信号,阻止沉默信号的长距离传导,回复GFP的沉默,但不能抑制由dsRNA引起的沉默。利用PVX在本氏烟上表达SP6能增强PVX的致病性。【结论】SP6是病毒编码的RNA沉默抑制子,在RNA沉默的起始和信号传导阶段起作用。     

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。     

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg（Viral protein genome\|linked）作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号（NLS）序列,C端具有核输出信号（NES）序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP\|VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP（n）标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。     

南京小麦梭条花叶病毒RT—PCR的分子鉴定

采自江苏省南京市郊区的小麦病毒病样品提纯后 ,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,结果表明 ,病毒外壳蛋白 (CP)为单一组分 ,相对分子质量为 36 5× 10 3 。经 1 2g·dL-1琼脂糖凝胶电泳检测 ,病毒核酸有两个组分 ,即RNA1和RNA2。根据AnbeSohn发表的小麦梭条花叶病毒RNA 13′端部分核苷梭序列 ,设计一对引物 ,以提纯样品的RNA1为模板 ,经RT PCR扩增出包含CP基因在内的 1 7kb的特异性目的片段 ,据此鉴定所采集的毒原为小麦梭条花叶病毒 (WSSMV)。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

纤细病毒属病毒的分子生物学研究进展

纤细病毒属（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）病毒粒体呈丝状,由核衣壳蛋白和基因组ＲＮＡ 组成．到目前为止,水稻条纹病毒基因组所有４个片段、水稻草状矮化病毒所有６个片段以及水稻白叶病毒和玉米条纹病毒除ＲＮＡ１外的其余片段的核苷酸序列已经测定．各成员所有ＲＮＡ 片段末端均具有共同的保守序列,并且两端互补配对形成锅柄结构．病毒基因组主要采取双义编码策略,但大部分可能编码蛋白的功能未知． ｍ ＲＮＡ 的转录可能采用了抓帽机制．纤细病毒属与白蛉热病毒属、番茄斑萎病毒属在基因组序列、结构和编码策略上的相似性表明,纤细病毒属可能归属于布尼安病毒科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）．     

辣椒黄瓜花叶病毒RNA提取及RT-PCR体系建立

以感染黄瓜花叶病毒病的辣椒叶片为材料,采用改进的Trizol试剂法提取病毒RNA.利用黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计特异引物进行检测,摸索适宜的RT-PCR体系.结果表明.改进的Trizol试剂法能获得较高质量和产量的病毒RNA,并能稳定地进行规模化检测.     

桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗体的制备及利用

对桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗原性较好的核心结构域进行克隆和序列多样性分析,结果表明50个克隆中有19个克隆株,CP16为优势株。构建重组表达载体pET-28a-SUMO-CP16,成功在大肠杆菌Rosetta中诱导表达该蛋白,利用亲和层析纯化重组蛋白并制备多克隆抗体。经Western杂交和ID-ELISA检测合格的抗体偶联Tosylactivated磁珠,用于桑花叶卷叶病相关病毒的纯化。经qPCR技术检测显示,纯化后的病毒样本中的背景RNA得到极大的减少,获得了高纯度的病毒样品。     

Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: responses in cattle and swine

A DNA sequence coding for the immunogenic capsid protein VP3 of foot-and-mouth disease virus A12, prepared from the virion RNA, was ligated to a plasmid designed to express a chimeric protein from the Escherichia coli tryptophan promoter-operator system. When Escherichia coli transformed with this plasmid was grown in tryptophan-depleted media, approximately 17 percent of the total cellular protein was found to be an insoluble and stable chimeric protein. The purified chimeric protein competed equally on a molar basis with VP3 for specific antibodies to foot-and-mouth disease virus. When inoculated into six cattle and two swine, this protein elicited high levels of neutralizing antibody and protection against challenge with foot-and-mouth disease virus.     

Autolytic processing of dimeric plant virus satellite RNA

Associated with some plant viruses are small satellite RNA's that depend on the plant virus to provide protective coat protein and presumably at least some of the proteins necessary for satellite RNA replication. Multimeric forms of the satellite RNA of tobacco ringspot virus are probable in vivo precursors of the monomeric satellite RNA. Evidence is presented for the in vitro autolytic processing of dimeric and trimeric forms of this satellite RNA. The reaction generates biologically active monomeric satellite RNA, apparently is reversible to form dimeric RNA from monomeric RNA, and does not require an enzyme for its catalysis.     

Specific inhibition of viral ribonucleic acid replication by Gliotoxin

Gliotoxin inhibits intracellular replication of poliovirus in HeLa cells at a stage subsequent to adsorption and penetration of virus. The sensitive step is synthesis of viral RNA: synthesis of viral protein is unaffected except as a consequence of blockade of RNA synthesis. Concentrations of gliotoxin sufficient to block viral RNA synthesis completely do not affect cellular RNA synthesis.     

Cofolding organizes alfalfa mosaic virus RNA and coat protein for replication

Alfalfa mosaic virus genomic RNAs are infectious only when the viral coat protein binds to the RNA 3' termini. The crystal structure of an alfalfa mosaic virus RNA-peptide complex reveals that conserved AUGC repeats and Pro-Thr-x-Arg-Ser-x-x-Tyr coat protein amino acids cofold upon interacting. Alternating AUGC residues have opposite orientation, and they base pair in different adjacent duplexes. Localized RNA backbone reversals stabilized by arginine-guanine interactions place the adenosines and guanines in reverse order in the duplex. The results suggest that a uniform, organized 3' conformation, similar to that found on viral RNAs with transfer RNA-like ends, may be essential for replication.     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

植物病毒基因介导的抗性研究进展

植物病毒是造成多种农作物减产和品质下降的重要病原之一,因其对植物细胞的绝对寄生性和致病的独特性,使得化学防治等常规措施难以发挥作用,而病毒分子生物学的发展和植物基因工程技术的出现,为防治植物病毒病开辟了新的途径。文章重点介绍了植物病毒外壳蛋白基因、复制酶基因、卫星RNA、运动蛋白基因介导的抗性等策略的抗病机理及存在问题,提出应加强对植物病毒基因介导的抗性机理和非病毒来源的基因介导的抗性等方面的研究,以期在植物抗病毒基因工程研究上获得质的突破和飞跃。     

鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR标准曲线的建立

笔者针对传染性支气管炎病毒（IBV）M41株中编码核衣壳蛋白的N基因设计并合成一对引物,通过构建重组阳性标准质粒的方法,成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测IBV的标准曲线。该方法所建立的曲线可检测到初始模板中5×10^2copies／μL的病毒核酸,与常规PCR相比敏感性大大提高。笔者建立的荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于传染性支气管炎的临床诊断和健康带毒鸡群的检测。     

犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。