山羊干酪性淋巴结炎病原的分离和鉴定

2010年9月从一起以皮下浅表淋巴结肿大,后期呈脓性干酪样坏死的山羊病例的脓汁中,分得一株多形态、无荚膜和芽胞的革兰氏阳性的球杆菌,该菌在马丁汤和马丁琼脂平板上生长缓慢,在麦康凯琼脂上不生长,但在鲜血琼脂或犊牛血清琼脂上生长良好,48h可长成直径在1mm大小,灰白色、不透明、干燥、中央突起、边缘不整齐,在鲜血琼脂平板上呈β型溶血的菌落。经对病原分离培养、生化试验、动物致病性试验和PCR检测鉴定该菌为伪结核棒状杆菌。并根据药敏试验的结果对病羊进行治疗,提出了综合防治措施。     

羊干酪性淋巴结炎的诊疗

<正>1发病机理该病是由伪结核棒状杆菌感染引起绵羊和山羊的一种接触性、慢性传染病,以局部淋巴结发生肿大、干酪样坏死为特征。主要经创伤感染,也可经消化道、呼吸道和吸血昆虫传播,死亡率一般不高。严重病例在肺、肝、脾和子宫角等处可发生大小不等的结节,内含淡黄绿色干酪样物质,如发现和治疗不及时会造成内部脏器病变而衰竭死亡。2临床症状病变多见于体表淋巴结,在羔羊中少见,随羊龄增长发病增多。感染初期局部发生炎症,后影响     

羊干酪性淋巴结炎研究进展

绵羊和山羊干酪性淋巴结炎(caseous lymphadenitis in sheep and goat ,简称CLA),也称绵羊和山羊伪结核病(pseudotuberculosis in sheep and goat),是由伪结核棒 状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)引起的一种人畜共患的慢性传染病.该 病主要多发于山羊和绵羊,但在其他动物及人的病变材料也曾分离到该菌[1].189 1年Preis z和Guinand由羊的肾脏脓肿首次分离到伪结核棒状杆菌,随后该病在全世界范围内各养羊国 家和地区广泛发现并报道,我国的很多养羊地区都有该病存在,往往由于羊毛产量减少、产奶量下降以及繁殖功能障碍,造成重大的经济损失[2].     

羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及ELISA检测方法的建立

从疑似山羊干酪性淋巴结炎羊的肩前淋巴结脓肿内分离到2株菌,经鉴定均为羊伪结核棒状杆菌。利用羊伪结核棒状杆菌标准菌株(ATCC19410株)制成外毒素作为检测抗原,通过酶标抗体、阳性血清、外毒素抗原最适浓度的选择试验,确定适当的抗原、抗体和酶标抗体稀释浓度,建立了间接ELISA方法用于检测抗体。用建立的ELISA方法检测100份待检羊血清,其中阳性血清4份,阳性检出率为4％。     

3种分支杆菌多重PCR快速检测方法的建立

本试验旨在构建一种以不同分支杆菌特异片段为目的基因的多重PCR检测方法。采用GenBank公布的结核分支杆菌RD10序列、牛分支杆菌moaB3序列、鸟分支杆菌16-23SrDNA序列设计并合成特异性引物,扩增产物条带分别为954bp、297bp、119bp。结果显示,三段目的基因都有很高的特异性,对比菌株均无扩增产物出现。对倍比稀释的模板质粒进行检测,该方法的最低检出量为103 copies/μL的DNA模板,该方法特异、敏感、重复性好。首次应用的moaB3基因所得扩增效果良好,成功区分出牛分支杆菌。此多重PCR方法可用于结核分支杆菌、牛分支杆菌、鸟分支杆菌的鉴别和牛结核病的快速临床检测。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立及CBP基因的序列分析

根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列,设计合成1对引物,通过对PCR条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了ORFV的PCR检测方法。敏感性与特异性结果显示,最低核酸检测量为1.2 fg/μL,对口蹄疫病毒、山羊痘病毒、丝状支原体山羊亚种的扩增结果均为阴性。同时根据GenBank中的ORFV的CBP基因的序列,设计合成1对特异性引物,以ORFV贵州分离株作为模板,成功克隆出ORFV的CBP基因。同源性分析表明,核苷酸与GenBank中ORFV的CBP基因的核苷酸序列相似性99.4%～88.8%。本研究为ORFV感染的流行病学调查和CBP基因功能研究奠定基础。     

羊泰勒虫与嗜吞噬细胞无浆体双重PCR检测方法的建立

为建立一种能快速对羊泰勒虫（ovine and caprine theileria）和嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytoph-ilum）同时进行检测的双重PCR方法。根据GenBank已报道的羊泰勒虫MPSP基因和羊嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因设计合成了2对特异性引物,通过条件优化,建立了双重PCR检测方法。双重PCR可特异扩增出羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体目的条带,片段大小分别为875bp和394bp。该方法具有较好的特异性,对羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的最低检出浓度为16fg/μL和1fg/μL。对采集的60份血液样本进行双重PCR检测,羊泰勒虫阳性率为46.67%(28/60),嗜吞噬细胞无浆体阳性率为13.33%(8/60),混合感染率为10%(6/60)。结果表明,双重PCR方法可用于羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的快速诊断和流行病学调查。     

羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法的建立及初步应用

试验根据羊泰勒虫 18S rRNA基因序列设计了3条引物,建立了羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法.该方法是基于一次PCR的一种提高PCR敏感性的方法,同时也保证了产物的特异性,并对吉林省珲春地区的65份羊抗凝血进行检测,旨在为今后羊泰勒虫病的诊断和流行病学调查奠定基础.     

副鸡嗜血杆菌PCR检测方法的建立

参照GenBank中已发表的副鸡嗜血杆菌血凝素（HA）基因设计合成了一对引物,预计扩增片段大小约为412bp。利用这对引物,通过对PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对副鸡嗜血杆菌的PCR检测方法。结果表明,该方法敏感性较高,最低可检出1．7×10^4CFU／mL的副鸡嗜血杆菌,对副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌在相同反应条件下未扩增出任何片段,说明该方法具有较好的特异性。     

猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断.     

鸭疫里氏杆菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌主要外膜蛋白A基因序列,在其保守区设计了1对引物,建立了检测鸭疫里氏杆菌的PCR方法,对鸭疫里氏杆菌进行检测,结果能扩增出预期片段,而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。说明该PCR法具有较好的特异性,可用于鸭疫里氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

分枝杆菌分型三重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定分枝杆菌的三重PCR方法,并比较分析其在临床检测中的可靠性。根据已发表的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌rv 3036c基因,结核分枝杆菌rv 1970f基因(RD7)和牛分枝杆菌pncA基因的序列,改造并设计合成了3对特异性扩增引物,建立了一种能对分枝杆菌样品进行初步鉴定的三重PCR方法。结果显示该方法可针对rv 3036c、rv 1970f和pncA基因分别扩增出大小为500、125和249 bp的目的片段,能特异性检测出结核分枝杆菌(500和125 bp两条带)和牛分枝杆菌(500和249 bp两条带),并可将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与其他分枝杆菌加以区分。本方法的检测灵敏度为50 pg/μL模板基因组DNA。对86株抗酸染色阳性菌进行三重PCR鉴定,鉴定结果与细菌16S rDNA和ITS序列测定结果一致,检测准确度为100%,优于生长特征和生化试验鉴定。     

Establishment and Application of Mycobacterium Typing Triple PCR Detection Method

This study was aimed to establish a triple PCR method to rapidly identify Mycobacterium species, and evaluate its testing reliability.Three pairs of primer that were respectively specific to rv 3036c, rv 1970f and pncA genes of Mycobacterium were designed to establish a triple PCR for preliminary identification of Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis), Mycobacterium bovis(M.bovis) and other Mycobacterium spp.PCR products were the expected sizes of 500(rv3036c), 125(rv1970f) and 249 bp(pncA), and contained two DNA bands(500 and 125 bp) with M.tuberculosis DNA template, two DNA bands(500 and 249 bp) with M.bovis DNA template.No band or non-specific band appeared with Mycobacterium spp.except M.tuberculosis and M.bovis DNA templates.The sensitivity of the triple PCR was calculated to 50 pg/μL template of genomic DNA.86 acid-fast bacteria were detected by the triple PCR, 16S rDNA and ITS gene sequencing, growth test and biochemical test, and the results were consistent between triple PCR and 16S rDNA and ITS gene sequencing.The detecting accuracy of triple PCR was 100%, and higher than growth test and biochemical test.     

猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用

根据NCB I中登录的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,应用Prim er Prem ier 5.0软件设计一对引物,经反应条件优化,建立PPV的PCR检测方法。经特异性和敏感性测定,其最低检测值可达6×10-3ng/μl。采用PCR方法对118份临床样品进行应用检测,结果检测到6份为阳性样品。     

鸭痘病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×10²拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。     

致病性嗜水气单胞菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank已登录的致病性嗜水气单胞菌保守序列16S rDNA和Aero,设计2对引物,以嗜水气单胞菌纯培养物为起始材料,建立PCR检测方法。从12株分离物中均扩增到16S rDNA片段,从3株分离物中均扩增到Aero片段,经序列测定和分析,所扩增的片段均为嗜水气单胞菌的核苷酸序列。结果表明,建立的PCR方法可用于检测致病性嗜水气单胞菌。     

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

非洲猪瘟给全球养猪业造成了严重危害,需要建立更加敏感的PCR检测方法.根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的VP72基因序列,设计PCR引物,建立了 ASFV PCR检测方法.以合成的VP72基因片段为阳性对照,进行敏感性试验和特异性试验.同时与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR引物进行对比试验.结果显示,建立的方法可用于...     

Establishment of TaqMan Real-time PCR Method for Detection of Duck Poxvirus

To establishment a TaqMan Real-time PCR method for detection of duck poxvirus (DPV),we cloned the P4b gene of DPV.The specific primers and probe were designed according to the nucleotide sequence of avipoxvirus available in GenBank.Recombinant plasmid pMD-DPV-P4b was employed as positive standard template for Real-time PCR.By optimization of reaction conditions,a TaqMan Real-time PCR method for detection of DPV was established.The results of specificity test proved this method had no cross-react with other waterfowl vial agents and poxviruses including avian influenza virus,duck flavivirus,duck hepatitis virus,Newcastle disease virus,duck entertitis virus,goose parvovirus,goatpox virus and fowlpox virus.The detection limit of the assay was 1.29×10² copies/μL of viral DNA,which was 100 times higher than that of the routine PCR.Reproducibility test showed that the CVs of intra assay and inter assay were both less than 2%.Above results supported that the assay was suitable for the detection of DPV very well.