甘蓝光敏色素B基因的克隆及在拟南芥中异源转基因的功能验证

目的】甘蓝（Brassica oleracea L.）是世界上最广泛种植的蔬菜作物之一,其种植已由春、秋两季种植转变为四季栽培,因此,研究甘蓝对光温的反应能力是品种改良的重要基础。光敏色素是植物最重要的一类光受体,主要响应远红光和红光的变化,其中,光敏色素B是红光的最主要受体,与光形态建成、避荫性以及生物产量等性状密切相关。克隆甘蓝的光敏色素B基因（BoPHYB）,在拟南芥中验证异源基因BoPHYB在光形态建成和避荫性反应中的作用,丰富植物光敏色素基因功能研究,评价光敏色素在甘蓝品种改良中应用的潜在价值。【方法】利用RT-PCR的方法克隆、测序验证得到甘蓝自交不亲和系12C的BoPHYB编码区cDNA序列;利用生物信息学软件分析其编码的氨基酸序列及结构域,并与其他植物的光敏色素B进行序列比对,分析它们之间的同源关系;构建其35S启动子驱动的植物表达载体pJIM19-Myc-BoPHYB,通过农杆菌介导法转化拟南芥野生型Col-0和phyB-9突变体,并获得纯合转基因株系;比较BoPHYB与拟南芥光敏色素B（AtPHYB-GFP）的转基因株系在不同光质下的下胚轴伸长和成株期的表型,验证其在光形态建成和避荫性反应中的作用。【结果】从甘蓝中克隆了BoPHYB的编码区cDNA序列,该基因编码区含有3 507个核苷酸,编码具有1 168个氨基酸残基、分子量为128.9 kD的蛋白质;与拟南芥和白菜的phyB结构域类似,BophyB包含1个GAF结构域、2个PAS结构域、1个HisKA结构域和1个HATPase_c结构域;氨基酸序列同源性分析发现,BophyB与拟南芥以及白菜的phyB同源性最高,与小麦、玉米、水稻等单子叶植物的同源性较低;与AtPHYB-GFP类似,在红光和白光下不但Myc-BoPHYB能互补phyB-9极端黄化的表型,而且转基因株系均表现为下胚轴加剧缩短;长日照和短日照下成株期转基因导致植株矮化、叶片深绿和叶柄缩短。【结论】克隆了甘蓝光敏色素B基因,甘蓝光敏色素B与拟南芥和白菜的光敏色素B具有相似的结构和功能,在红光和白光下促进幼苗的去黄化反应,在成株期显著抑制长日照和短日照下植株的避荫性反应。     

玉米2个光敏色素A基因的克隆、蛋白结构与光诱导表达模式

【目的】分析玉米2个光敏色素A基因(ZmPhyA1和ZmPhyA2)的蛋白结构及可能存在的功能区段,明确其响应于不同光线处理的表达模式。【方法】通过RT-PCR方法获得ZmPhyA1和ZmPhyA2编码的完整cDNA序列,推断2个基因编码蛋白的保守结构域,利用酵母双杂交测试其结构域间的物理互作,利用半定量RT-PCR技术分析不同光处理条件下ZmPhyA1和ZmPhyA2的表达模式。【结果】遗传进化树分析表明,ZmPHYA2与高粱光敏色素A的遗传关系要比与ZmPHYA1更近。ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白中含有1个GAF结构域、1个Phytochrome结构域、2个PAS结构域、1个HisKinaseA结构域和1个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构。ZmPHYA1与ZmPHYA2自身和相互之间可以通过其C端539个氨基酸区段进行相互作用。ZmPhyA1和ZmPhyA2在黑暗、远红光和蓝光条件下表达量较高,在红光和白光条件下较低,并且前者的表达量均低于后者。【结论】ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白是2个具有功能的光受体蛋白,自身和相互之间可能通过C端539个氨基酸区段互作形成复合体,二者的表达水平受不同光质的调控。     

花生光敏色素AhphyA和AhphyB基因的克隆及原核表达研究

【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

光敏色素的生物学功能及其调控

光是影响植物生长发育的重要因素,植物为感受光而进化出光受体。光受体分为4类,其中光敏色素研究较为深入,它是红光和远红光受体,在光形态建成过程中发挥着重要作用。近年来的研究阐明了光敏色素的作用模式,以及由其介导的光信号转导途径和植物发育调节过程,如下胚轴延伸、茎分支、生物钟及开花时间控制等。基于目前的研究总结光敏色素的生物学功能及其介导的光信号转导途径,并展望其研究前景,以期为相关领域研究提供参考。     

谷子光敏色素家族基因的生物信息学及表达模式分析

光敏色素(PHY)是植物体重要的光感受器,在光形态建成中发挥重要作用.为挖掘新型模式植物谷子的光敏色素基因,通过BLAST从xiaomi基因组中共鉴定出4个SiPHYs,命名为SiPHY-1、SiPHY-2、SiPHY-3、SiPHY-4.利用生物信息学方法对SiPHYs的基因结构、理化性质、系统进化、启动子顺式作用元件和不同时期不同组织的表达谱进行分析,并采用RT-qPCR分析6个品种(系)在不同光周期下SiPHYs差异表达.结果表明,4个SiPHYs分布在8号和9号染色体上,除SiPHY-2外其余3个成员均为酸性亲水性蛋白;系统进化显示,SiPHY-1和SiPHY-2为PHYA亚族,SiPHY-3为PHYB亚族,SiPHY-4为PHYC亚族,且SiPHYs与狗尾草SvPHYs、玉米Zm-PHYs、高粱SbPHYs的亲缘关系近,与拟南芥AtPHYs亲缘关系较远;SiPHYs的顺式作用元件中光响应元件占比最多.表达谱分析结果显示,SiPHY-1可能与谷子的种子萌发有关,SiPHY-3可能与谷子形态建成有关,SiPHY-4可以调控谷子的抽穗开花期;进一步对6个品种(系)不同光周期下的差异表达显示,SiPHY-1在晋谷21和大同红谷中差异显著,SiPHY-3在大同红谷中差异显著,SiPHY-4在晋谷21、xiaomi、黄粟和xiaomi4中差异显著,而Si-PHY-2在不同光周期和不同材料中表达量均很低或不表达,说明SiPHY表达量受光周期和基因型的影响.     

茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术在茎瘤芥幼苗叶片中克隆了茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段,命名为BjPHYB1(GenBank登录号:JQ178243)。结果表明,该片段长1 544 bp,编码514个氨基酸;该氨基酸序列包含两个完整的PHYB保守结构域PHYTOCHROMEREGION和PAS DOMAIN,且与甘蓝和拟南芥PHYB同源性分别为98%和96%;系统进化树分析表明BjPHYB1与同科植物的PHYB亲缘关系较近。茎瘤芥PHYB基因片段为首次克隆,为今后对该基因功能研究奠定了基础。     

高羊茅光敏色素A基因FaPHYA的克隆与分析（英文）

以高羊茅转录组学测序获得的PHYA序列为模板,同时结合3’RACE和5’RACE方法从高羊茅中扩增出PHYA基因的全长c DNA序列,命名为Fa PHYA。该序列c DNA全长3 983 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,293~3 682 bp),编码蛋白为1 129个氨基酸,Fa PHYA的N端由GAF和Phytochrome结构域组成;C端包括2个重复的PAS结构域,1个组氨酸激酶A结构域,1个类似组氨酸激酶的ATP酶结构域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,Fa PHYA与单子叶植物PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较高,同源一致性水平达85%以上,亲缘关系较近。与双子叶植物的PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较低,亲缘关系相对较远。     

耐辐射奇球菌光敏色素基因缺失突变株的构建及其功能研究

利用PCR和体内同源重组技术，对耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans R1）中光敏色素基因诱导缺失突变，构建了突变株bphP^-。对突变株分别进行不同剂量电离辐射（IR）和不同浓度过氧化氢（H2O2）处理，并以野生株R1做对照。结果表明：与野生株相比，突变株bphP^-对过氧化氢的敏感性明显上升，而对电离辐射的抗性野生型基本不变。不同性质的光照试验显示，强白光对野生菌株和光敏色素突变的耐辐射奇球菌都具有显著的抑制菌落生长作用，两者差异不明显。红光和蓝光对野生株和突变株的生长都没有明显的抑制作用。强白光照射对没有光敏色素调控体系的大肠杆菌K12菌株抑制不明显。因此，耐辐射奇球菌中光敏色素可能主要是作为氧化环境信号传递和调控的蛋白。     

一个光敏色素B调控的水稻NBS-LRR基因的表达模式分析

利用水稻基因芯片比较野生型、phyA和phyB突变体受连续红光照射后的基因表达图谱,从中筛选到一个受光敏色素B(phyB)介导的红光信号特异诱导的、编码NBS-LRR类蛋白的基因,命名为PB-LRR(phyB-regulated NBS-LRR).为了揭示PB-LRR基因在水稻生长发育中的作用,对该基因表达的器官特异性...     

拟南芥光敏色素D(AtphyD)在不同光质下的表达特性分析

【目的】比较拟南芥光敏色素D启动子、基因及其蛋白在黑暗、红光、远红光及蓝光下表达特性。【方法】通过GUS组织染色,半定量RT-PCR及蛋白Western blot检测启动子、基因及其蛋白的表达。【结果】GUS染色显示:子叶中,PHYD基因启动子活性在红光下高于蓝光,且均高于远红光条件;下胚轴中启动子的活性在蓝光条件下最高,远红光条件有较高丰度表达,红光条件下仅在下胚轴上部检测到活性;在根中,蓝光和远红光下生长的幼苗根的上部可检测到启动子的微弱表达,红光下未见表达。在黑暗中生长的幼苗,光敏色素D基因启动子未发生表达。PHYD基因转录和蛋白表达在光下均高于黑暗条件下,不同光质间的表达差异不显著。【结论】在不同光质中,PHYD基因启动子在不同组织的活性存在显著差异;不同光质之间,PHYD基因转录和蛋白表达差异不显著。     

玉米ZmCBL5-2基因的克隆及其转化拟南芥

CBLs(calcineurin B-like proteins)是植物细胞中1个重要的Ca2+传感蛋白家族,它们广泛参与植物对高盐和干旱等非生物逆境的应答反应。在玉米基因组中存在至少9个CBL编码基因,其中ZmCBL5因为存在可变剪接而有编码框为657bp和444bp两种转录本,我们称之为ZmCBL5-1和ZmCBL5-2。本论文运用RT-PCR方法克隆了ZmCBL5-2的编码框cDNA,然后构建了其植物表达载体并转化了拟南芥,经PCR检测证明获得T1代转基因植株,为进一步研究其在抗逆性中的作用奠定了基础。     

2个玉米光敏色素C基因的转录丰度对多种光质处理的响应

【目的】通过NCBI数据库获得2个玉米PHYC及相关数据,并进行相关生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析2个玉米PHYC在玉米各器官的转录丰度,以及其转录丰度对多种光质处理、黑暗到各种光质转换和光周期处理(长日照和短日照)的响应,为研究玉米PHYC在玉米幼苗去黄化与开花期的调控机制奠定基础。【方法】采用玉米B73自交系为研究材料,通过RT-PCR分别对Zm PHYC1和Zm PHYC2的全长ORF序列进行克隆;借助相关软件对其进行生物信息学分析,利用q RT-PCR分析这两个基因在玉米各器官中的转录丰度,及其转录丰度对各种光照处理的响应。【结果】Zm PHYC1和Zm PHYC2的全长ORF均为3 408 bp,编码1 135个氨基酸基序,分子量分别为126.14和126.07 k D。生物信息学分析表明,玉米phy C蛋白可以分为6个功能区段:节奏周期蛋白—Ah核转运接受蛋白—专一蛋白区段(Per-Arnt-Sim,PAS)、c GMP受激磷酸二酯酶区段(GAF)、色素区段(PHY)和PAS相关区段(PRD,包含2个PAS区段)、组氨酸激酶A区段和组氨酸激酶ATP酶区段,但是Zmphy C2在PRD区段仅有一个PAS区段。氨基酸水平的系统发育树分析表明,Zmphy C1和Zmphy C2与禾本科物种phy C有很高的一致性,且与甘蔗和高粱phy C的亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明,Zm PHYC1和Zm PHYC2的表达在根和叶中的转录丰度均较高,同时对持续蓝光和白光响应强烈;在黑暗到各种光质转换处理中,这两个PHYC的表达模式相似。在黑暗转到远红光、红光、蓝光和白光的0.5 h,Zm PHYC1和Zm PHYC2的转录表达均急剧上升,随后迅速下降到自身起始黑暗时的水平以下,并上下波动。这两个基因对长日照和短日照的光周期处理也能积极响应,在长日照条件下,2个Zm PHYC出现了极其相似的表达模式,均在光照和黑暗阶段各出现1个峰值;在短日照条件下,这两个基因的表达模式差异较大,Zm PHYC1的峰值出现在进入黑暗后6 h,而Zm PHYC2的峰值出现在进入光照阶段2 h。【结论】玉米phy C蛋白可以分成6个功能区段,但是Zmphy C2在PRD区段仅具有一个PAS相关区段。2个玉米PHYC转录丰度具有组织特异性。在各种光质处理中,Zm PHYC1和Zm PHYC2的表达模式相近,可能二者存在功能冗余,在转录水平上前者的丰度高于后者,推测Zm PHYC1在玉米中起更重要的作用,并且可能二者在功能上存在分工。Zm PHYC1和Zm PHYC2对各种光质和光周期处理均有较强的响应,推测二者在调控玉米光形态建成和开花中具有重要作用。     

拟南芥CYP76C2基因(At2g45570)的克隆及其菌核病抗性功能分析

以拟南芥基因组DNA为模板,扩增出细胞色素P450(CYP76C2)基因的ORF,成功构建了CYP76C2基因的过表达载体并获得转基因植株.通过离体和活体接种表明,CYP76C2基因的过表达植株对核盘菌的抗性增强.     

色素基因在玉米遗传育种上的实践经验与体会

了解色素基因在玉米籽粒性状和植株色泽遗传育种上的应用 ,目的是为了选育遗传性状较为稳定的玉米新品种 ,以提高玉米良种的品质和纯度。     

家蚕细胞色素C基因的克隆及其蛋白在家蚕凋亡细胞中的释放

 【目的】细胞色素C是线粒体凋亡路径上的关键因子,通过家蚕细胞色素C基因的克隆和其蛋白在家蚕凋亡细胞中的释放研究,为家蚕细胞凋亡的研究奠定基础。【方法】利用生物信息学和分子生物学方法克隆家蚕细胞色素C基因,通过紫外线照射诱导家蚕细胞凋亡,应用流式细胞仪和Western-blotting检测家蚕凋亡细胞的线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放。【结果】在家蚕中克隆了一个含有细胞色素C保守结构域的同源基因,该基因cDNA长570 bp,有3个外显子,开放阅读框（open reading frame,ORF）长324 bp,编码108个氨基酸,存在参与细胞凋亡时与下游凋亡蛋白酶激活因子（Apaf－1）相互作用的保守关键位点;紫外线诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1凋亡后12 h,细胞线粒体跨膜电位明显下降,同时检测到了细胞色素C由线粒体向细胞质释放。【结论】在家蚕细胞凋亡中可能存在细胞色素C由线粒体释放的路径。     

拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,该片段与GenBank上报道的序列具有100%的同源性。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pLEELA为基础,构建了由组成型启动子35S调控的AtPP2C基因的植物表达载体pLAT35S。     

民猪细胞色素C氧化酶Ⅰ基因的克隆、多态性检测及冷诱导研究

采用克隆测序和PCR- SSCP方法对民猪COX Ⅰ基因序列及多态性进行了检测与分析,采用实时荧光定量PCR法对同一饲养水平下经冷诱导处理的民猪和长白猪肌肉、肝脏组织中COX Ⅰ基因的表达变化进行分析.结果表明:民猪的COX Ⅰ基因序列与其他猪种相比,存在18个核苷酸突变,导致5个氨基酸发生变化;C260T、G275A和C1253T位点民猪以B等位基因占优势,大白猪、长白猪、北京黑猪、野猪则是A等位基因占优势;冷诱导后低温组民猪COX Ⅰ基因的表达量与常温组民猪和低温组长白猪相比,均显著下降(P＜0.05).据此推测冷诱导可导致COX Ⅰ基因表达量降低从而产生更多的ATP为机体提供能量抵御寒冷,COX Ⅰ基因可能是一个与猪的抗寒性显著相关的候选基因.     

玉米大斑病菌蛋白激酶C基因的克隆及表达规律分析

 【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息学分析表明,PKC全长DNA序列为3 837 bp、cDNA序列为3 516 bp。由7个外显子和6个内含子组成,编码产物包含1 171个氨基酸残基。在1 380 bp的上游侧翼序列中包含CAAT-box及TATA-box,并且存在热激转录因子(HSF)结合元件和SP1、AP1等结合元件。PKC在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在。半定量RT-PCR结果表明：在以蔗糖为碳源时PKC表达量高于其它碳源,铵态氮为氮源时PKC的表达明显受到抑制。重金属离子Mn2+、Cu2+、Zn2+显著抑制PKC表达。在高渗胁迫环境中下,山梨醇抑制PKC表达,且抑制程度与浓度成正相关;而高浓度NaCl造成高渗胁迫时,PKC由低浓度NaCl时的低丰度表达状态中被激活,表达量迅速增加。【结论】玉米大斑病菌PKC及其启动子的成功克隆与该基因的表达规律丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

蒺藜苜蓿生物钟基因MtTOC1a的克隆及功能验证

【目的】分析蒺藜苜蓿Medicago truncatula生物钟基因MtTOC1a的蛋白结构,探究MtTOC1a在生物钟系统中的生物学功能,比较其与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtTOC1功能相似性和差异性。【方法】通过生物信息学分析,在全基因组范围内鉴定了TOC1在蒺藜苜蓿中的同源基因。构建MtTOC1a基因的表达载体,利用农杆菌介导法引入到拟南芥野生型Col、及相应的功能丧失突变体toc1-2中,进行遗传互补分析。【结果】Mt TOC1a和MtTOC1b均具有保守的功能结构域和三维结构。遗传分析表明,在早期光形态建成中,外源转化的MtTOC1a完全恢复了toc1-2的下胚轴伸长表型,但对toc1-2的提前开花表型没有显著影响。在引入CAB::LUC报告基因的株系中,外源转化MtTOC1a在连续光照下使短周期突变体toc1-2的近日节律周期延长,但仍不能完全恢复至野生型水平。【结论】MtTOC1a和拟南芥AtTOC1的功能存在相似性,但在不同的下游调控途径中所扮演的角色存在差异。本研究结果为进一步探索MtTOC1a基因的功能,利用MtTOC1a基因改造苜蓿的重要性...     

玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26两个可变剪接体的功能分析

【目的】探讨蛋白磷酸酶2C在植物生长发育和逆境抗性中的作用。【方法】利用逆转录PCR扩增玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26的两个可变剪接体,用生物信息学工具预测其推导蛋白的特性后,转化野生型拟南芥,并进行功能验证和亚细胞定位。【结果】在较短剪接体中切除的213nt第一内含子,在较长剪接体中被保留。第一个内含子的剪接位点为5′-CC..CG-3′,与植物中通常的组成型剪接位点5′-GT..AG-3′不同。保留内含子及其侧翼序列的G/C含量较高,相当于其他内含子及其侧翼序列的2倍。两个剪接体在野生型拟南芥中的异源表达均可增加其对干旱胁迫的敏感性。两个剪接体推导蛋白的预测三维结构均与PP2C相似,较长剪接体保留内含子编码的71个冗余氨基酸序列保持随机螺旋状态,预测为叶绿体定位信号肽。绿色荧光蛋白标记法定位表明,较长剪接体定位于细胞核、细胞膜和细胞器,而较短剪接体定位于细胞核和细胞膜。【结论】ZmPP2C26基因转录后加工过程中发生内含子保留型可变剪接。第一个内含子的保留没有改变其编码蛋白的PP2C功能,但有可能使其作用由细胞核和细胞膜延伸至叶绿体。