猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N基因保守序列设计引物与TaqMan探针,在建立常规PCR的基础上,设计并优化了TaqMan荧光定量PCR方法用于PRRSV核酸的检测.应用新建立的荧光定量PCR方法检测其它主要猪病病原,无任何非特异性反应;针对PRRSV阳性克隆质粒的检测灵敏度可以达到1.2×101 copy/ml,比常规PCR高100倍;通过对48份临床疑似样本的检测表明有29份样本为PRRSV阳性,与巢式PCR检测结果一致,而常规PCR只能检出其中19份阳性样本,灵敏度优于常规PCR方法.结果表明,试验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为PRRSV临床诊断提供一个更为有效的方法.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸道综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μl;利用该方法对3份不同的组织样品进行重复性检测,计算出平均循环阈值的标准差分别为0.14、0.14和0.44,变异系数分别为0.01%、0.01%和0.02%,说明该方法具有良好的重复性和重现性。对阳性组织病料的检测表明,该方法与常规RT-PCR的阳性符合率为100%,但其检测灵敏度较常规RT-PCR约高100倍。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

根据文献合成1对针对PRRSV毒株ORF6基因高度保守序列的引物,建立用于检测PRRSV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR诊断方法.提取PRRSV-LC病毒RNA,经所建立的荧光定量RT-PCR方法扩增,可获得特异的扩增曲线,而日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒(PCV)进行同条件检测,结果为阴性;方法可检测到1 TCID_(50) PRRSV,比琼脂糖凝胶电泳敏感度高10～100倍.结果表明,所建立的PRRSV荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和科学研究.     

GCLV病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)的外壳蛋白基因的保守序列设计了一对引物,以全基因序列合成的方法获得质粒标准品,以此质粒标准品为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测GCLV的方法.该方法在4.2×101~4.2×107拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为106%,最低可检测42拷贝/PCR反应阳性标准品,比常规PCR敏感100倍;扩增产物的溶解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(77.5±0.9)℃;重复性好,组内变异系数为0.2%~1.1%.用该方法对疑似带病的大蒜材料进行检测,结果表明GCLV-SYBR GreenⅠPCR特异性强,操作简便,敏感性高,可以用于GCLV感染的检测及定量分析.     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)的gB基因片段,构建含有gB基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRV-gB基因重组质粒为模板应用SYBR Green I方法来建立检测PRV-gB基因载量的荧光定量PCR方法。结果显示:在(8.6×107~8.6×101)copies/μL范围内,回归方程为y=-3.5604x+41.165,其决定系数为0.9993,显示出优良的线性关系;扩增产物的熔解曲线仅有一个特异性单峰。该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪细环病毒等常见猪源DNA病毒进行检测时均没有扩增曲线,重复性试验的变异系数小于2%,表明建立了特异性强、重复性好、灵敏性高的PRV-gB基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。用该方法检测8种商品伪狂犬病弱毒活疫苗的每头份剂量的病毒载量,结果显示不同商品伪狂犬病弱毒活疫苗之间的病毒载量存在明显差异,与其标识剂量基本一致,表明该荧光定量PCR检测方法可用于疫苗剂量检测。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为100.4%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P0.05)高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like分离株致病力分析

为探究天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的流行情况,从天津市某猪场发病猪肺脏组织中分离到 1 株PRRSV,扩增其 Nsp2 基因,核苷酸序列比对结果显示该病毒属 NADC30 分支,与 TJnh1501 株同源性最高,命名为 TJ18114 株,并对其感染细胞能力和对猪的致病力进行了研究。结果显示：该毒株能够在 Marc145 细胞上稳定增殖,引起明显的细胞病变,最佳收获时间为 72 h(0.1MOI 接种),TCID₅₀为 10^6.445·mL^-1;用 2×10⁵TCID₅₀·头^-1的剂量经肌肉注射结合鼻腔喷雾方式接种 45 d 杜长大三元猪,猪只感染后 24 h 体温升高至 40 ℃以上,血液中病毒载量达 10^7.3copies·mL^-1;感染后 7 d PRRSV 抗体阳转率 100%;感染后 15 d 猪只消瘦、咳喘,剖检可见间质性肺炎,显微病理观察提示弥漫性肺泡萎缩、炎性浸润;PRRSV...     

我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子演化及与疫苗毒株的比较分析

为了解我国大陆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子演化特点,为PRRS防控提供参考,对GenBank中收录的60株PRRSV ORF5基因和NSP2基因进行序列分析.根据ORF5基因和NSP2基因构建的进化树分析表明,我国毒株主要分为4大亚群,其中亚群1为主要分支,以2006年分离的JXA1株为代表的HP-PRRSV毒株,我国HP-PRRSV可能起源于CH1-a和HB-1 (sh)/2002株,其变异是逐渐演变的过程.目前我国流行的毒株中HP-PRRSV占绝对优势,且与高致病性疫苗株(JAX1和HUN4株等)同源性较高.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞的增殖规律

摘要:猪繁殖与呼吸综合征病毒可以在原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)、CL2621细胞系及Marc-145细胞系上生长繁殖，但对于其增殖规律不甚了解。试验利用实时荧光定量PCR技术，研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律；结果发现:病毒在接种后12 h开始大量增殖，在18-36 h增殖最为迅速，在36-48 h病毒增殖达到最高峰；研究还发现在18 h 时Marc-145细胞开始释放病毒，48 h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供试验基础。     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。     

鸡马立克氏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立1种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的荧光定量PCR检测方法.[方法]用RT-PCR方法扩增TGEV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,基于SYBR Green方法以不同浓度的TGEV-N基因重组质粒作为模板进行检测TGEV的荧光定量PCR扩增.[结果]TGEV SYBR Green荧光定量PCR的扩增效率为101％,标准曲线的决定系数为0.9997,可准确检测的最低核酸模板浓度为490 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对其他3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法.[结论]建立了1种TGEV SYBR Green荧光定量PCR检测方法,可用于TGE的早期快速诊断.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物.分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PER条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PER诊断方法.应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株.试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PER诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据.     

实时荧光定量PCR法检测草莓镶脉病毒

为了建立一种特异、灵敏、快速检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据已有的检测SVBV的引物信息,合成引物,对不同草莓品种进行PCR扩增。经过克隆、测序及序列比对得到了感染SVBV的阳性植株,利用此植株PCR扩增产物构建重组质粒作为标准品,优化了PCR反应体系,标准曲线的循环阈值（Ct值）与模板浓度有良好的线性关系（R2=0.999 1）;进行了灵敏度和重复性试验,敏感性可达到101拷贝·μL-1,约为普通PCR的1 000倍,重复性好;并与常规PCR方法进行了比较,成功建立了检测SVBV的实时荧光定量PCR法。用该方法检测了部分草莓品种的DNA样品,结果表明,大部分植株都带有SVBV。该方法具有很高的灵敏性和重复性,可用来快速检测草莓植株是否感染SVBV。