家蚕小分子热激蛋白BmHsp19.1基因克隆及在蚕卵中的表达特征

小分子热激蛋白(small heat shock proteins, sHsps)是细胞抵御压力首先反应的蛋白,目前家蚕卵滞育相关的sHsps研究较少.为了更好地了解sHsps在滞育过程中的作用,以转录组筛选出的差异表达基因BmHsp19.1为研究对象,通过生物信息学分析、基因克隆、 PCR等方法对其进行克隆鉴定及在滞育卵、非滞育卵等蚕卵中的表达特征进行分析.结果发现：BmHsp19.1基因ORF框全长507 bp,编码168个氨基酸,理论分子量为19.06 kDa,有典型的Hsp20结构域,属于sHsps家族;qRT-PCR结果显示该基因在滞育卵3～7 d表达量上调,而在非滞育卵中仅在第7 d上调表达,且滞育卵中表达量显著高于非滞育卵,暗示BmHsp19.1基因在蚕卵进入滞育时可能发挥作用,起到了保护机体免受损伤的抗逆作用.结果为解析BmHsp19.1基因功能提供了有用的信息,也为其他昆虫的sHsps研究提供了一些有价值的参考.     

家蚕热激蛋白Hsp25.4对BmNPV增殖的影响

【目的】探究家蚕热激蛋白（Hsp25.4）基因在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,Bm NPV）侵染家蚕后的表达变化规律,明确敲低该基因表达后对BmNPV增殖复制的影响,为深入解析BmHsp25.4蛋白在BmNPV侵染家蚕过程中发挥的作用提供参考依据。【方法】以5龄家蚕幼虫为研究对象,经口添食10μL预先制备好的BmNPV-T3株病毒悬液（5×108个/mL）,对照组添食等量灭菌水,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因在BmNPV侵染6 h各组织的表达情况,并选择相对表达量较高的3个组织,分析BmHsp25.4基因时空表达图谱;注射双链RNA(dsRNA)检测BmHsp25.4基因在体内的干涉效果,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因干涉后对BmNPV增殖复制的影响。【结果】BmNPV侵染家蚕6 h,BmHsp25.4基因在家蚕血液、中肠和脂肪体组织中的相对表达量升高;时空表达谱结果显示,BmHsp25.4基因在3个组织中的表达谱均呈先升高后降低的变化趋势,其中血液和中肠组织的相对表达量均在6h达峰值,而脂...     

家蚕己糖激酶基因进化分析及其多转录本在胚胎早期发育过程中的表达特性

【目的】明确家蚕（Bombyx mori）二化性品系胚胎早期发育过程中己糖激酶基因（BmHK）不同转录本的表达特性,为深入探究BmHK基因各转录本的生物学功能及揭示其在家蚕胚胎早期发育中的作用机制提供理论依据。【方法】从NCBI检索并下载家蚕等12种昆虫的HK氨基酸序列,采用MEGA 7.0的邻接法（NJ）构建基于HK氨基酸序列相似性的系统发育进化树。以家蚕二化性品系秋丰活化越年蚕卵（丙2胚胎）为材料,分别制备非滞育命运卵（ND）、滞育命运卵（DD）和即时浸酸卵（IA）,采用实时荧光定量PCR检测BmHK基因各转录本在家蚕二化性品系胚胎早期发育过程中的表达特性。【结果】BmHK基因属于HSP70-actin家族,存在4个不同的转录本,其长度分别为4610、4608、2818和1520 bp,依次命名为BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。BmHK-a在3种蚕卵胚胎早期发育过程中整体上呈先升高后降低的变化趋势,且各时间点均表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵,IA蚕卵中的BmHK-a相对表达量于发育2 h达峰值,在ND蚕卵和DD蚕卵中于发育48 h达峰值,此后其表达快速下调,至发育96 h均处于较低水平;BmHK-b在3种蚕卵中的表达水平整体上表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵,3种蚕卵中的BmHK-b相对表达量变化趋势基本一致,均随发育时间推移呈逐渐上升趋势;BmHK-c在3种蚕卵中的表达差异明显,初产蚕卵中已有较高的表达水平,受精后迅速升高,至发育72 h后BmHK-c在3种蚕卵中的相对表达量再次升高;BmHK-d在3种蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势,且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵,但IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵。【结论】BmHK-a和BmHK-d主要在家蚕胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用;BmHK-b虽然也参与家蚕胚胎早期发育过程,但不是主要的糖代谢相关酶;BmHK-c与家蚕胚胎早期发育关系密切,通过糖酵解为胚胎发育提供能量。     

家蚕滞育激素受体基因的克隆及在多化性和二化性品种间的表达差异

为探究无滞育多化性家蚕品种‘MF'体外注射滞育激素(DH)后不能产下滞育卵这一现象是否与DH诱导的下游信号通路受阻有关,丰富鳞翅目昆虫的滞育发生机理,本研究从滞育激素信号接受器——滞育激素受体(DHR)人手,从该家蚕‘MF'品种中克隆了DHR基因的全长cDNA,结构分析表明该基因编码的蛋白质与其他家蚕品种存在差异。运用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术检测滞育激素受体基因在不同家蚕品种蛹期的血液和卵巢以及同一家蚕品种‘MF'5龄幼虫的不同组织(血液、头部、脂肪体、丝腺、中肠及卵巢)中的表达水平。结果表明:DHR在家蚕‘MF'品种幼虫的5个组织中都有表达,在血液和卵巢组织中表达较高;另外该基因的表达水平在不同化性家蚕品种存在差异,即使在同为无滞育多化性的2个品种间也存在显著差异,在‘MF'品种中的表达水平明显低于‘尼斯塔里'。推测滞育激素受体的表达量不足可能与‘MF'品种蛹期注射滞育激素不能产生滞育卵有一定的关联。     

用于家蚕转基因的二化性品种蚕卵的预处理研究

从二化性品种获得优质的非滞育蚕卵作为显微注射受体,一直是家蚕转基因技术中亟待解决的问题之一. 目前家蚕转基因技术中非滞育蚕卵主要是通过完全低温暗催青、早浸酸2种方法得到,但这2种方法分别存在催青 时间长、浸酸时间难以把握的局限.对完全低温暗催青技术进行了改进,即在家蚕胚胎发育至温度敏感的缩短期 (戊3 期)后再对蚕卵低温黑暗处理直至孵化,结果表明:后期低暗组能有效地获得非滞育蚕卵并且较完全低暗组催 青时间缩短3~4天.并进一步分析了后期低暗组、完全低暗组以及早浸酸组3种处理得到的非滞育卵的健康性, 结果表明后期低暗组和完全低暗组健康性差异不大,均明显优于早浸酸组;后期低温暗催青在蚕卵孵化所需时间 上具有明显的优势,且获得的非滞育卵健康性亦可得到保证,有望成为人们获得非滞育卵的一条有效途径.     

高浓度氧处理法阻断蚕卵滞育

【目的】比较高浓度氧处理法(高氧法)与传统HCl处理法(HCl法)阻断蚕卵滞育效果的差异,探讨高氧法阻断滞育在家蚕Bombyx mori转基因技术体系上的应用。【方法】采用高氧法和HCl法在产后20 h处理二化性蚕品种‘大造’,比较孵化率、孵化时间,调查高氧法的最佳处理条件;将高氧法应用于一化性蚕品种‘土耳其’和转基因二化性蚕品种‘大造’,调查其对一化性蚕品种蚕卵阻断滞育效果及转基因二化性蚕品种显微注射后蚕卵阻断滞育效果。【结果】高氧法对二化性蚕卵在孵化率、孵化时间上都与HCl法有相近的阻断滞育的效果,其最佳条件为产卵后20 h用体积分数为70%的O2处理40 h;该方法也能成功阻断一化性蚕品种,孵化率达(71±20)%;高氧法处理的显微注射转基因家蚕卵孵化率达到了(49±9)%,而对照组的孵化率为0。【结论】高氧法为今后生产上替代HCl法,采用安全环保的蚕卵阻断滞育技术,解决转基因蚕卵阻断滞育和提高转基因家蚕育种进度的关键问题提供了可行的新方法。     

家蚕卵形指数对孵化率的影响及孵化相关基因表达分析

[目的]分析家蚕卵形指数对孵化率的影响规律,以及孵化酶基因(BmHE I和BmHE II)、几丁质酶基因(Chitinase)和周期蛋白基因(Period)在不同卵形间的表达规律,为阐明家蚕卵形指数与孵化率的相关性及其分子机理打下基础.[方法]调查家蚕Nistari品种野生型正常形品种(Nistari+)及其新突变体纺锤形品种(Nistari-)的卵形指数、孵化率、受精率和转青死卵率,分析其卵形指数与孵化率的相关性;并通过实时荧光定量PCR检测蚕卵胚胎发育后期孵化相关基因的表达情况.[结果]Nistari+蚕卵的平均卵形指数为1.26,极显著低于Nistari-蚕卵(1.73)(P<0.01,下同);孵化率为96.22%,极显著高于Nistari-蚕卵(51.33%).当Nistari+蚕卵的卵形指数为1.24~1.25时,其孵化率(97.39%)和受精率(98.84%)均最高,转青死卵率最低(2.61%);而Nistari-蚕卵的卵形指数为1.77~1.81时,其孵化率(56.52%)和受精率(74.87%)均最高,转青死卵率最低(43.48%).相关分析结果表明,Nistari蚕卵孵化率、受精率和转青死卵率与卵形指数存在一定的相关性,且受卵形指数影响.在蚕卵胚胎发育后期(孵化前),Nistari+蚕卵的BmHE I、BmHE II、Chitinase和Period基因大量表达,对应的相对表达量显著(P<0.05)或极显著高于NISTAR-蚕卵.[结论]家蚕Nistari品种的卵形指数与孵化率存在一定相关性,而BmHE I、BmHE II、Chitinase和Period基因的表达差异是导致Nistari-蚕卵与Nistari+蚕卵孵化率差异的分子基础.     

高、低温催青诱导家蚕滞育发生中的蛋白质修饰

【目的】研究高、低温诱导家蚕Bombyx mori滞育发生时蚕卵蛋白质修饰的差异,为后续深入探究昆虫滞育诱导的分子机制提供参考。【方法】饲养二化性家蚕品种,筛选出稳定的受高、低温诱导滞育发生的家蚕品系。以此为材料,分别于25和15℃孵化蚕卵,敏感期和点青期取样进行表观遗传学研究,通过SDS-PAGE电泳和Western blot检测蛋白修饰的差异。【结果】高温(25℃)组蚕卵蛋白的甲基化修饰水平始终高于低温(15℃)组,点青期有显著差异;高、低温处理组之间的乙酰化修饰水平一直差异显著,在点青期高温组显著低于低温组;低温组的泛素化修饰水平始终高于高温组,尤其是发育前期;磷酸化修饰水平整体较高,但高、低温处理组之间差异不显著;丙二酰化在高、低温处理组之间没有明显差异;琥珀酰化的修饰水平始终较低,在发育后期有明显的差异修饰蛋白出现。【结论】蚕卵在25℃催青过程中蛋白质泛素化和乙酰化修饰水平与15℃低温组在全时期都存在显著差异,甲基化修饰水平在点青期存在显著差异,表明甲基化、泛素化和乙酰化修饰在家蚕早期滞育诱导过程中起作用。     

细胞周期蛋白家族基因在家蚕胚胎期的表达分析

【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在滞育卵与即时浸酸处理的滞育卵发育过程中的转录活性,为家蚕胚胎发育及细胞周期调控机制研究提供参考。【方法】以家蚕品种大造为试材,取产后1~8d的滞育卵及产后20h即时浸酸的非滞育卵,提取其RNA反转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR方法分析家蚕Cyclin家族基因在胚胎发育过程中的转录水平。【结果】在即时浸酸处理的家蚕非滞育卵中均能检测到Cyclin家族基因的表达,但不同发育阶段Cyclin家族基因表达量差异很大,在发育开始的1~3d,Cyclin家族基因变化显著,说明此期细胞分裂频繁,正处于组织和器官活跃形成时期。在胚胎发育晚期,除CyclinL1外的其他基因表达量都很低,表明此时幼虫器官发育几近完成,因此细胞分裂迟缓。而滞育卵从蛾体产下经过3d后,细胞分化停滞于G2期,Cyclin家族基因也进入沉默状态。【结论】Cyclin家族基因在家蚕胚胎发育过程中具有重要的调控作用。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

烟夜蛾(Helicoverpa assulta Guenée)滞育激素基因时空表达的研究

利用RT PCR法,在转录水平上对烟夜蛾滞育激素(Diapausehormone,DH)基因的时空表达进行了研究.结果表明,该基因在滞育诱导条件下饲养的烟夜蛾3,4,5,6龄幼虫及滞育蛹中表达,在已解除滞育的蛹体内该基因同样表达.但在正常条件下饲养的烟夜蛾幼虫及非滞育蛹虫体中未见表达.对烟夜蛾滞育蛹脑部、胸部、腹部的RT PCR检测表明,脑部为DH基因的表达部位.     

shRNA下调家蚕细胞系BmCREB的表达

sh RNA(short hairpin RNA)是一种干扰基因表达、研究基因功能的有效方法。CREB(c AMP response element binding protein)是真核生物重要而又保守的转录调控因子,参与许多生理功能的调节。作者前期的研究发现,家蚕CREB(Bm CREB)的表达与家蚕滞育的诱导密切相关。为进一步阐明BmCREB调控家蚕滞育的分子机制,利用p MD18-T质粒构建BmCREB的干扰质粒p MD18-U6-shRNA,转染家蚕卵巢细胞系(BmN),对其下调BmCREB的表达进行研究。结果表明,在BmN细胞系中转染1μg shRNA,72 h后能有效地下调BmCREB蛋白的表达量,最高干扰效率达63.0%。不同干扰片段shRNA质粒的干扰效果差异很大,其中T-227的干扰效果最好。这些结果为进一步利用shRNA方法在家蚕体内下调基因表达,研究BmCREB基因与家蚕滞育的关系奠定基础。     

不同冷藏温度对家蚕卵磷脂量的影响

家蚕滞育卵对低溫的抵抗性与卵内磷脂的代谢有一定关系。家蚕卵在5℃和1℃冷藏120天后,卵磷脂和脑磷脂的含量分别比冷藏前增加了50％左右。     

家蚕浸酸活化滞育卵早期胚胎发育的难溶性蛋白质差异表达分析

【目的】用盐酸刺激活化家蚕滞育卵的孵化,是蚕种生产长期沿用的一项人工孵化技术,但盐酸能活化滞育卵的机制却有许多未明之处,为此,从蛋白质组学的角度探讨盐酸对蚕卵滞育解除的作用关系。【方法】用双向电泳技术和电喷雾串联质谱技术,比较分析冷藏45 d的滞育卵浸酸前后的难溶性卵蛋白的差异表达。【结果】根据双向电泳图谱分析,在浸酸前的图谱中共检测到296个蛋白点,浸酸后的检测到302个蛋白点,两者相匹配的蛋白斑点有265个,匹配率为88.6％。特异性的蛋白点,浸酸前有31个,浸酸后有37个。对浸酸前存在、经浸酸处理后消失的2个特异性差异的高丰度蛋白点用电喷雾串联质谱技术作分析,NO.1蛋白序列与浆膜蛋白（chorion protein [Bombyx mori]）有55个氨基酸的肽段相匹配,NO.2蛋白序列与热激蛋白（heat shock protein hsp 19.9 [Bombyx mori]）只有15个氨基酸的肽段相匹配,推测是一种未知蛋白。【结论】滞育性蚕卵经浸酸后,难溶性卵蛋白有差异表达,浸酸前后的一些蛋白种类或分子量发生了变化。     

HCl和DMSO阻断滞育条件下桑蚕卵壳电镜观察

【目的】探讨桑蚕Bombyx mori滞育阻断机理,比较HCl、二甲基亚砜(DMSO)法阻断蚕卵滞育后卵壳表面发生的一系列变化。【方法】用HCl和DMSO分别在产后20和12 h处理蚕卵,利用扫描电镜观察卵壳表面及气孔在处理后不同时间点的变化。【结果】HCl和DMSO处理均能成功地阻断蚕卵滞育的发生,蚕卵平均孵化率分别为93.37%和87.81%。扫描电镜观察HCl和DMSO处理的卵壳表面蚀刻效果明显,均出现了“脂质”脱落物;并且处理后蚕卵的气孔有逐步增大的趋势,与DMSO处理相比较,HCl处理获得的现象更为明显。【结论】卵壳表面变化可能与桑蚕滞育的阻断有关。     

家蚕滞育人工解除及其机理研究进展

家蚕是卵滞育的昆虫,其滞育与滞育解除对蚕业生产密切相关.综述分析了近年国内外有关家蚕滞育人工解除的研究方法,包括低温处理、浸酸处理和H2O2处理等,并对滞育解除的机理进行了探讨.     

中国野桑蚕DH-PBAN基因克隆研究初报

根据家蚕(Bombyx mori)滞育激素-性信息素合成激活肽(DH-PBAN)基因的DNA序列设计引物,以中国野桑蚕(Bombyx mandarina China)基因组DNA为模板进行PCR扩增.试验首先确立了比较稳定的从基因组扩增目的片段的扩增体系及程序,并用该扩增体系及程序克隆到中国野桑蚕DH,PBAN及DH-PBAN基因的第5内含子序列.试验还发现该基因第3内含子在家蚕和野桑蚕之间表现出多态性.     

Polycomb家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.     

家蚕TCTP基因的克隆、分析及其表达

 【目的】在家蚕基因表达谱研究中鉴定了近4万个特异的SAGE标签，为了研究这些标签所对应基因的功能，选择了其中一个SAGE标签，探索这个SAGE标签对应的基因序列，表达特征以及相关的功能。【方法】在SAGE结合GLGI结果的基础上，利用5’RACE获得基因的全长，根据不同物种间该基因的同源性来构建系统发生树，通过PCR检测该基因在家蚕不同时期、不同组织中的表达特征，并在原核表达系统中表达该基因。【结果】从cDNA中获得了家蚕TCTP基因的全长序列，构建了不同物种间TCTP的系统发生树，PCR结果表明TCTP基因在家蚕的各个时期、各个组织中都稳定的表达，并且成功的在原核表达系统中表达了该基因。【结论】从cDNA中获得了TCTP基因的全长序列，并且成功在原核系统中表达，证明了通过笔者的实验方法能够获得新的基因；系统发生树显示亲缘性越近的物种TCTP间的同源性越高；家蚕TCTP基因在家蚕生命的各个时期、各个组织都有重要的生物学功能；这些工作为进一步研究其具体功能奠定了基础。     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。