云南烟草产区辣椒脉斑驳病毒的调查及其遗传多样性分析

明确辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus, ChiVMV)在云南6个州(市)烟草生产区的分布、遗传多样性和群体遗传结构,对病害的防控预警具有重要意义。本研究以2022年采集自云南6个州(市)不同烟草产区的96份疑似感染ChiVMV的烟草样品为试验材料,利用电子显微镜负染色观察和分子生物学方法对病毒进行检测和鉴定,获得21个ChiVMV云南烟草分离物的cp基因序列。利用SDT、MEGA、RDP、DnaSP及Arlequin等生物学软件对21个云南烟草分离物及NCBI上下载的38个来自不同国家、地区及寄主的ChiVMV分离物cp基因序列的系统进化、遗传多样性和群体遗传结构特征进行分析。结果显示,从云南6个州(市)烟草生产区采集的96份烟草样品中,ChiVMV检出率为51.04%;序列比对发现,本研究获得的cp基因与NCBI中38个ChiVMV分离物cp基因的核苷酸一致性在84.1%以上;系统发育分析发现,59个ChiVMV分离物按照地理位置的远近被划分为4个分支,聚类结果具有明显的地理分布特征,而与寄主植物无关;遗传多样性和遗传分化分析表明,4个地理种群的ChiVMV cp基因遗传多样性水平均较高,中国种群与印度、泰国和其他国家种群间发生了很大的遗传分化且差异显著(P<0.05);遗传力分析显示,基因交流、遗传漂变和基因的负选择压力是ChiVMV分离物适应性进化的重要方式。     

基于CP基因的中国云南省烟草TMV群体遗传多样性分析

为探明云南烟草上烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的群体遗传多样性特征, 本研究使用TMV外壳蛋白(coat protein, CP)基因的特异性引物对采自云南各烟区的疑似烟草花叶病样品进行检测, 通过克隆测序获得138个TMV CP基因序列, 对其进行了一致性比对, 及系统发育、错配分布、遗传变异、群体多样性等分析。变异分析显示, 138条CP基因序列共有变异位点数122个, 占总位点数的25.42%, 变异类型只有核苷酸替换, 核酸多样性为0.018, 单倍型多样性为0.970;一致性比对结果显示, 138条序列的核苷酸和氨基酸序列一致性均为96%～100%; 重组分析未检测到重组信号;对来自云南烟草, NCBI上其他地区烟草及云南地区其他寄主的TMV分离物的CP基因进行系统发育分析, 结果显示, 所有TMV分离物在进化上可分为4个组, 本试验获得的分离物分布在1、2、3组, 其中只有来源昭通地区的分离物倾向于聚成簇, 表明云南烟草TMV分离物的适应性进化受地理适应性所驱动, 与寄主适应性基本无关;错配分布分析显示, 云南烟草TMV群体呈多峰分布, 表明该群体近期未经历群体扩张事件; 群体间遗传分化分析结果表明, 除昭通和曲靖烟草TMV群体与其他TMV群体之间很容易发生遗传漂变促使群体发生遗传分化外, 其余大部分TMV群体之间的基因流都可以抵制遗传漂变。本研究首次报道了云南各烟区TMV分离物群体遗传变异情况, 研究结果可为TMV的抗病育种和制定更为有效的防治策略提供重要参考。     

基于外壳蛋白基因的湖南烟草黄瓜花叶病毒遗传多样性分析

为探明湖南烟草上发生的黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的遗传多样性及分子进化特征,对来自湖南烟区的303份疑似感染病毒的烟草样品进行检测,分析CMV系统发育、遗传变异和群体结构等特征。结果表明：部分分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)基因与NCBI上登录的CMV分离物的一致性为86.34%～98.42%;系统发育分析发现湖南烟草CMV分离物属ⅠB组,不同组间的分离物地理特征不明显,无重组现象,进化的主要驱动力是负选择;组间遗传变异比较明显,基因交流频率较低,受到遗传漂变影响,遗传多样性高,群体趋于扩张。研究结果为烟草抗CMV育种提供了理论依据,对病害防治具有重要意义。     

太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%~99.0%之间,氨基酸序列同一性在93.5%~99.3%之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBW V2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。     

基于全基因组编码区序列的烟草花叶病毒分子进化分析

为揭示烟草花叶病毒分子进化特征,从GenBank中下载已报道的烟草花叶病毒全基因组编码区序列,进行重组、系统发育、遗传变异、种群结构和基因漂流等分析。结果表明:突变和负选择作用是驱动烟草花叶病毒进化的主要作用力,种群结构稳定,处于扩张趋势中,基因变异程度低,重组在烟草花叶病毒分子进化中作用不明显。烟草花叶病毒不同分离物形成3个有一定地理相关性的种群ChinaⅠ、ChinaⅡ和Europe。欧洲分离物核苷酸序列多样性比中国的差异大,Europe和ChinaⅠ种群可能受到遗传漂变影响,Europe与ChinaⅡ、ChinaⅠ与ChinaⅡ之间存在发生基因交流的渠道。     

甘薯褪绿斑病毒山东分离物全基因组扩增及遗传进化分析

为了解甘薯褪绿斑病毒(sweet potato chlorotic fleck virus, SPCFV)在山东省的发生及遗传进化情况,分别于2019年和2020年采集了131份甘薯样品,针对SPCFV进行病毒检测、全基因序列扩增、序列分析及遗传进化树构建。结果显示：SPCFV两年的检出率分别为7.1%和5.6%,所有SPCFV感染样品中皆为SPCFV与其他病毒的复合侵染。通过RACE和RT-PCR获得CFV-SD1和CFV-SD2两个全基因组序列,全长均为9 105 bp;与已报道分离物核苷酸序列一致性为72.9%～89.5%。全基因组遗传进化分析显示所有SPCFV分离物聚为两簇。且从不同样品中获得6个SPCFV山东分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)序列,基于CP氨基酸序列开展遗传进化分析表明,山东分离物均归于亚洲类群的第一簇(Asian isolates 1)。氨基酸偏好性分析显示,CP氨基酸序列N端前35位同样存在多变区。本研究表明了山东省已成为SPCFV的常发区域,且病毒群体存在多样性,研究结果为指导SPCFV的有效防控提供了理论依据。     

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

从山东省感病的烟草上分离获得了一烟草蚀纹病毒(TEV)分离物,命名为TEV-SD1.根据已报道烟草蚀纹病毒外壳蛋白(coat protein CP)基因序列设计并合成2条引物,通过RT-PCR扩增得到长度约800bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了包含TEV CP基因的原核表达载体pETEV-CP,并导入大肠杆菌BL21中.序列分析表明:TEV-SD1的CP基因全长789bp,编码263个氨基酸;与GenBank中已报道的TEV 5个分离物CP基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为94.1%～98.6%.37℃培养条件下,BL21/pETEV-CP经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示,表达的TEV CP融合蛋白的相对分子质量约为33 kDa.以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/2048,且具有良好的特异性.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查

为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进化分析,利用特异性引物扩增获得CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备CGMMV CP抗血清进行Western-blot和Dot-ELISA检测。结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的3个CGMMV分离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由6 423 nt构成;3个全序列间的核苷酸同源性高达99.11%~99.67%,编码的CP氨基酸同源性为100%。系统进化分析发现,CGMMV不同分离物形成2个进化相关群体,3个浙江的CGMMV分离物均位于第I组内,与已报道的中国CGMMV分离物和韩国CGMMV分离物亲缘性较高。Western-blot检测表明CGMMV CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于CGMMV鉴定;Dot-ELISA检测发现CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。     

烟草蚀纹病毒山东分离物全基因组序列的克隆和保守性分析

为利用RNA介导的病毒抗性策略,培育抗性稳定或抗多烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）株系的转基因植株,采用RT-PCR及5＇-RACE方法克隆了烟草蚀纹病毒山东分离物TEV-SD1的全基因组序列。TEV-SD1全基因组核苷酸序列长度为9494 bp,包含1个9165 bp的开放阅读框架（open reading frame,ORF）,编码3054个氨基酸。将TEV-SD1基因组序列与GenBank中已公布的4个TEV全基因组序列和11个外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列比对分析发现,各分离物CP基因间的核苷酸和氨基酸序列平均相似性分别为96.65%和98.31%,高于其它功能基因间的相似性;各分离物CP基因3＇端核苷酸序列相似性平均为96.55%,高于5＇端序列。聚类分析发现TEV在自然界中的分子变异与其寄主关系密切。     

韭葱黄条病毒厦门分离物外壳蛋白基因序列分析及其分组

 本文在测定了侵染厦门古宅大蒜的病毒分离物（LYSV XM）CP基因序列的基础上,进一步从GenBank登录的58个分离物中选取具有代表性的29个分离物建立CP基因核苷酸序列系统进化树。利用该系统进化树明确了LYSV XM与其他分离物间的进化关系,并在前人研究基础上提出一种基于CP基因核苷酸序列的类群分组方法。     

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

 根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3'端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。     

广西柑橘衰退病和黄脉病调查及其病原病毒的遗传多样性分析

为明确柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus, CTV)和柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)在广西柑橘上的发生?分布及其遗传变异情况, 于2020年至2021年对百色?北海?崇左?贵港?桂林?河池?贺州?来宾?柳州?南宁?梧州和玉林等12个柑橘产区进行了病毒病调查?采用RT-PCR对采集样品进行了病毒检测, 并基于病毒分离物外壳蛋白(coat protein, CP)基因的核苷酸序列进行比对分析, 构建系统发育树?结果表明:采集的737份柑橘样品中, CTV的检出率为20.62%, CYVCV检出率为18.32%, CTV的检出率略高于CYVCV?病毒复合侵染的现象在采集的柑橘样品中普遍存在, CTV和CYVCV复合侵染率高达34.50%?对RT-PCR产物测序共获得12个CTV分离物和6个CYVCV分离物的CP基因序列?遗传多样性分析发现, CTV和CYVCV的CP基因序列都较保守, CTV分离物的遗传进化与地理来源?寄主来源均没有明显相关性, 但CYVCV分离物的遗传进化与地理位置具有相关性, 而与寄主来源无明显相关性?上述研究结果可为深入了解CTV和CYVCV在广西的流行情况以及柑橘病毒病的检疫和防控提供参考?     

菜豆普通花叶病毒RT-PCR承检测及3'末端序列分析

根据哈尔滨地区豇豆感病植株的症状,初步鉴定感染豇豆的病毒为菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus,BCMV).利用马铃薯Y病毒属通用引物扩增出病毒基因组3'末端序列,经BLAST检索表明该病毒为BCMV,将该序列与GenBank上的21个BCMV分离物的3'末端序列进行比较,显示其核苷酸序列与其他分离物的序列同源性为91.7%～97.3%.系统进化分析显示不同分离物可聚为5个类群,并显示出一定的寄主相关性.哈尔滨分离物BCMV-X与2个浙江分离物、1个澳大利亚分离物聚为一支,且该4株分离物的寄主均为豇豆.RNA二级结构分析显示BCMV基因组3'末端非编码区形成4个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化.     

山西苹果茎痘病毒遗传多样性分析

苹果茎痘病毒是苹果安全生产的巨大威胁,严重影响苹果产量和质量。探讨苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)在山西省的分布、变异和多样性,可为制定可持续的病毒管理策略提供理论依据。从山西省11个地区采集苹果叶片样品进行RT-PCR检测。结合在线数据库,利用相关软件对文中研究获得的序列进行系统发育、遗传多样性、重组以及种群遗传分化等分析。RT-PCR检测结果显示从山西省11个地区采集的409份苹果叶片样品中,ASPV的检出率为36.33%(临漪)至55.37%(平遥)。选择15个ASPV检测为阳性的样品,分别克隆其CP基因并与22个不同的ASPV分离物进行核苷酸和氨基酸一致性分析,发现37个ASPV分离物的核酸一致率为70.27～96.31%,氨基酸一致率为37.04～96.64%,其中,Shanxi-2与JX673826.1的核酸一致率最高,为90.86%, Shanxi-2与MN617853.1的核酸一致率最低,为70.40%。基于CP的进化树分析结果显示37个ASPV分离物被划分为2个进化群体。遗传多样性分析结果表明ASPV种群发生了收缩,且在两个...     

菜豆普通花叶病毒RT-PCR检测及3′末端序列分析

根据哈尔滨地区豇豆感病植株的症状,初步鉴定感染豇豆的病毒为菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus, BCMV)。利用马铃薯Y病毒属通用引物扩增出病毒基因组3′末端序列,经BLAST检索表明该病毒为BCMV,将该序列与GenBank上的21个BCMV分离物的3′末端序列进行比较,显示其核苷酸序列与其他分离物的序列同源性为91.7%～97.3%。系统进化分析显示不同分离物可聚为5个类群,并显示出一定的寄主相关性。哈尔滨分离物BCMV X与2个浙江分离物、1个澳大利亚分离物聚为一支,且该4株分离物的寄主均为豇豆。RNA二级结构分析显示BCMV基因组3′末端非编码区形成4个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。     

马铃薯Y病毒云南昭通烟草分离物的检测及年度间差异比较

利用DAS-ELISA检测试剂盒检测昭通烟草脉斑病样品,结果表明存在马铃薯Y病毒O株系和马铃薯Y病毒N株系两个不同株系病毒。利用Sprimer和M4引物扩增、克隆、测序,得到长度为1 771 bp目的片段,该片段包含病毒的外壳蛋白基因序列、3′ UTR序列以及部分Nib基因序列;序列分析表明与湖南HN 2分离物（GenBank No. GQ200836）和美国NE 11分离物（GenBank No. DQ157180）核苷酸序列相似性均为98%,系统进化分析表明其具有较近的亲缘关系。     

甜菜西方黄化病毒两个山东辣椒分离物全基因组扩增及序列分析

 通过RACE和RT-PCR技术相结合的方法,在山东省潍坊市和济宁市辣椒上克隆出2个甜菜西方黄化病毒(beet western yellows virus,BWYV)的全基因组序列,基因组全长均为5 699 nt。与GenBank比对发现,2个分离物的5′UTR(Untranslated region,UTR)变异程度小、相对比较保守,而3′UTR变异程度大、为突变热点区域。潍坊、济宁两地分离物与GenBank中该病毒的全基因组序列相似度平均值分别为89.89%和89.72%。系统进化树分析发现BWYV亚洲地区的分离物聚类在3个不同的组别,本研究克隆的2个山东分离物和3个日本分离物(LC428355、LC428356、LC428357)、2个韩国分离物(LC198684、KM076647)聚在一组,而美国分离物与法国分离物聚在其他分支,表明该病毒的进化存在地理相关性。这是首次对BWYV中国辣椒分离物的全基因组序列克隆,丰富了BWYV的序列信息,有助于进一步了解该病毒种群的遗传进化关系。     

甜菜西方黄化病毒两个山东辣椒分离物全基因组扩增及序列分析

 通过RACE和RT-PCR技术相结合的方法,在山东省潍坊市和济宁市辣椒上克隆出2个甜菜西方黄化病毒(beet western yellows virus,BWYV)的全基因组序列,基因组全长均为5 699 nt。与GenBank比对发现,2个分离物的5′UTR(Untranslated region,UTR)变异程度小、相对比较保守,而3′UTR变异程度大、为突变热点区域。潍坊、济宁两地分离物与GenBank中该病毒的全基因组序列相似度平均值分别为89.89%和89.72%。系统进化树分析发现BWYV亚洲地区的分离物聚类在3个不同的组别,本研究克隆的2个山东分离物和3个日本分离物(LC428355、LC428356、LC428357)、2个韩国分离物(LC198684、KM076647)聚在一组,而美国分离物与法国分离物聚在其他分支,表明该病毒的进化存在地理相关性。这是首次对BWYV中国辣椒分离物的全基因组序列克隆,丰富了BWYV的序列信息,有助于进一步了解该病毒种群的遗传进化关系。