稻瘟菌二肽基肽酶V基因DppV的功能分析

为明确二肽基肽酶V（dipeptidyl-peptidase V,DppV）在稻瘟菌Magnaporthe oryzae中的生物学功能,采用在线软件对稻瘟菌DppV进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR（quantitativereal-time PCR,qRT-PCR）技术分析其在稻瘟菌分生孢子不同萌发时间的表达量,通过基因敲除和功能回补、致病力测定等方法对其功能进行分析。结果表明,稻瘟菌DppV蛋白含有信号肽,定位于胞外,不含跨膜结构域,没有GPI锚定位点,为经典分泌蛋白,含DAP2结构域;其与小麦顶囊壳Gaeumannomyces tritici、早熟禾巨座壳Magnaporthiopsis poae、新烟曲霉Aspergillus novofumigatus和巴斯德伊蒙菌Emergomyces pasteurianus蛋白序列的相似度较高,分别为68.92%、68.41%、51.09%和49.96%;在稻瘟菌分生孢子萌发早期DppV基因均有表达,但当萌发时间为24 h时,其相对表达量最高,为5.61;稻瘟菌DppV基因敲除突变体菌株的菌落生长速度明显下降,产孢量（8.18×10⁴个/cm²）和4个产孢相关基因MoHox2、MoCon8、MoSec22和MoCos1的相对表达量显著降低,分生孢子萌发率（56.21%）明显下降,对SDS、NaCl、山梨醇和H₂O₂胁迫更加敏感,对水稻的致病力显著降低,水稻植株内真菌生物量明显减少,而稻瘟菌DppV基因回补菌株的表型、耐胁迫能力和致病力等则恢复到稻瘟菌野生型菌株的水平。表明DppV基因在稻瘟菌营养生长、产孢、致病力、对外界胁迫的应答及其在水稻体内的定殖等方面起着重要作用。     

离体水稻叶片划伤接种鉴定稻瘟菌的致病型

抗瘟品种的培育和抗瘟基因布局需要快速、准确、大规模地定性水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌致病型。为此, 本研究建立了水稻离体叶片划伤接种方法。该方法依据主效抗瘟基因抵抗稻瘟菌在寄主体内扩展的特点, 通过针刺在水稻叶片上造成伤口, 避免了寄主侵入抗性的干扰, 从而有利于抗扩展性的定性鉴定。作者利用活体喷雾接种、叶片无划伤接种和本研究建立的离体叶片划伤接种等3种接种方法, 在秧苗4~6叶龄期, 对菌株12-DG-68在24个水稻抗瘟单基因系上的致病反应进行了测定, 结果显示：叶片划伤接种的检测结果稳定、一致; 而叶片无划伤接种和活体喷雾接种的检测结果假抗性比例分别为12.5%和4.2%, 不同叶龄期的叶片间反应型不一致率达7%。此外, 离体叶片划伤接种还可利用菌丝块接种, 以鉴定分生孢子产量低的菌株的致病型。因此, 水稻叶片划伤接种是一种准确、稳定和方便的稻瘟菌接种方法, 可用于大规模定性测定水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌的致病型。     

钙离子响应蛋白GCaMP6s在稻瘟菌中的异源表达

稻瘟病严重威胁全球水稻的产量,钙离子信号通路参与了稻瘟菌生长、发育和致病,了解这些过程中菌株细胞质中钙离子浓度的变化对稻瘟病的防治具有重要意义.GCaMP6s作为一种细胞质钙离子感受蛋白在动物和植物中已有大量应用.本研究利用不同稻瘟菌菌株构建了 GCaMP6s基因的异源表达菌株,在0.01 g/mL钙离子处理下,GCa...     

稻曲病菌SIX效应蛋白参与调控植物免疫

为明确稻曲病菌Ustilaginoidea virens的SIX(secreted in xylem)效应蛋白功能,利用生物信息学软件预测6个SIX1蛋白和1个SIX2蛋白的分泌特性,并通过酵母分泌系统对其分泌特性进行验证,在烟草上通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的瞬时表达系统检测SIX蛋白对小鼠促凋亡蛋白BAX、致病疫霉Phytophthora infestans激发子INF1、大豆疫霉Phytophthora sojae病原相关分子模式糖基水解酶XEG1引起烟草细胞坏死的作用,在烟草上表达SIX蛋白后接种辣椒疫霉Phytophthora capsici并观察其对辣椒疫霉侵染的作用。结果显示:所检测的SIX蛋白中有5个含有预测的信号肽,2个被预测为非经典分泌蛋白,但经酵母分泌系统验证均具有分泌功能;大部分SIX蛋白能够抑制BAX、INF1、XEG1引起的烟草细胞坏死,但抑制坏死的情况并不完全一致;大部分含信号肽的SIX蛋白能够促进辣椒疫霉侵染,UV8b＿3638去信号肽突变体也能够促进辣椒疫霉侵染。表明大多数SIX蛋白参与调控植物免疫,且能促进病原...     

小麦条锈菌细胞质效应子Hasp8抑制植物基础免疫

为明确小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici效应子Hasp8的功能,以小麦条锈菌CYR31侵染水源11小麦叶片的cDNA为模板,通过PCR技术扩增获得Hasp8基因的完整编码区序列,采用qRTPCR技术测定Hasp8基因的表达情况,利用农杆菌介导马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)瞬时表达体系在烟草上验证Hasp8基因是否能够抑制由Bax蛋白诱导的细胞坏死,将Hasp8基因构建到pCAMBIA1302载体用于在烟草上瞬时表达Hasp8进行亚细胞定位以明确该效应蛋白的作用空间;并将Hasp8基因构建到p EDV6载体上用于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens介导的瞬时表达系统以明确该效应蛋白是否能够抑制病原相关分子模式引发的免疫反应和效应蛋白诱导的免疫反应。结果表明,Hasp8基因编码117个氨基酸,N端含22 aa的信号肽;qRT-PCR结果显示,Hasp8基因在小麦条锈菌CYR31侵染小麦水源11的早期上调表达。烟草瞬时表达Hasp8基因能够抑制由Bax诱导的细胞坏死;烟草上亚细胞定位发现效应子Hasp8...     

葡萄座腔菌候选效应子抑制了Bax诱导的PCD反应并促进烟草疫霉的侵染

 轮纹病是苹果生产中发生严重又难以防治的病害。为探究致病机理,本研究选择葡萄座腔菌的3个候选效应子进行研究。农杆菌介导的烟草瞬时表达显示,Bdo_01520、Bdo_11198、Bdo_11545都能够完全抑制Bax诱导的烟草PCD反应。酵母分泌系统测试表明3个候选效应子的信号肽都具有外泌活性。qRT-PCR测定候选效应子在葡萄座腔菌ZY7有伤接种苹果果实后的相对表达量,结果显示3个基因在病菌侵染36~72 h上调表达。在本生烟中瞬时表达Bdo_11198显著促进了烟草疫霉的侵染,并降低了疫霉菌侵染后本生烟中活性氧的积累。结果表明,葡萄座腔菌候选效应子可以通过影响植物的PCD反应和过氧化氢积累促进病原菌的侵染,研究结果为进一步研究葡萄座腔菌的致病机制提供了基础。     

稻瘟菌对水稻品种梅雨明的无毒性的遗传分析和分子标记

 将交配型为a、并对水稻品种梅雨明不致病的稻瘟菌菌株S1522与对该品种致病的、交配型为A的稻瘟菌菌株P131和S159杂交,分别获得了24和56个单子囊孢子后代。致病性测定结果表明:这些后代菌株在梅雨明上的致病个体与不致病个体的比例近等于1:1。由此推测:稻瘟菌对水稻品种梅雨明的无毒性是由1个基因控制的。进一步通过RAPD比较了致病后代与不致病后代的DNA多态型,获得了1个与该无毒基因连锁的、长度为1000 bp的RAPD标记,两者间的遗传距离为3.7cM。     

水稻抗稻瘟菌HIGS表达载体的构建及遗传转化

水稻是我国主要粮食作物之一,而稻瘟病是影响水稻安全生产的最主要病害之一。为克服抗病基因的抗病性很快消失的弊端,本研究尝试了宿主诱导的基因沉默(HIGS)技术在创制抗稻瘟病水稻新材料上的可行性。HIGS是新发展起来的以RNAi为基础的抗病技术,即在寄主植物中表达可沉默病原物特定基因的HIGS载体,达到控制病原菌扩展的目的。本研究选取了两个稻瘟菌致病关键基因Nox1和NAC为研究靶标,分别克隆其UTR区和CDS区中的特异区段,利用Gateway技术构建这4个片段HIGS表达载体,再利用农杆菌介导法将各载体分别转化水稻,通过鉴定得到转基因阳性植株,为后续开展该技术在水稻抗稻瘟病方面的深入研究奠定了基础。     

小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主免疫反应

 由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦上的重要病害。研究小麦条锈菌在致病过程中分泌的毒性效应蛋白分子的功能,对揭示小麦条锈菌致病机理,进而研发病害防治新方法具有重要意义。前期在小麦条锈菌吸器转录组中筛选到一个高丰度表达的分泌蛋白基因HASP2。HASP2基因全长240 bp,其编码的蛋白质N端包含22_aa的信号肽,无跨膜区,无结构域。qRT-PCR显示HASP2在条锈菌CYR32侵染早期上调表达;农杆菌介导的烟草瞬时表达实验表明HASP2能够抑制由小鼠凋亡蛋白BAX诱导的烟草细胞坏死;利用细菌三型分泌系统(T3SS)将 HASP2在小麦中过表达,发现其可以抑制寄主PTI(PAMP-triggered immunity)相关胼胝质积累;同时对HASP2过表达的小麦接种无毒性菌系CYR23后,发现HASP2可以抑制寄主ETI(Effector-triggered immunity)相关活性氧积累和减少细胞坏死面积,但HASP2过表达对条锈菌的生长发育没有显著影响。     

稻曲病菌Six1类效应蛋白UvSix1-1的功能研究

 稻曲病菌在侵染过程中会分泌大量的效应蛋白来帮助其侵染。本研究鉴定到一个稻曲病菌效应蛋白UvSix1-1,同源序列比对及系统发育分析发现其具有Six1蛋白保守的氨基酸位点,并与多个病原菌中的Six1蛋白具有同源性。进一步研究发现UvSix1-1可以抑制Bax、XEG1和INF1引起的烟草叶片细胞坏死,并且其预测的信号肽区域具有分泌功能,在烟草上瞬时表达UvSix1-1可以促进辣椒疫霉的定殖。对不同稻曲菌株中的序列进行分析,没有发现序列多态性,说明该基因非常保守。以上研究结果表明,UvSix1-1在病原菌侵染过程中发挥作用,研究结果为稻曲病菌效应蛋白的研究提供参考。     

条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累

 条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)导致的小麦条锈病严重威胁着我国的小麦生产安全。解析病菌的致病机理,对开发病害防控技术与策略具有重要的指导意义。研究发现效应子是病菌重要的致病因子,揭示效应子调控寄主免疫机制可加深对病菌的认知。本课题组前期在全基因组筛选条锈菌效应子中获得了一个候选效应子基因Pst30,该基因所编码的蛋白N-端含有分泌肽,无明显功能结构域。qRT-PCR分析显示Pst30在条锈菌侵染小麦后12 h诱导表达,72 h诱导表达至高峰。利用农杆菌侵染在烟草中瞬时表达Pst30^ΔSP-GFP融合蛋白,发现Pst30^ΔSP定位在细胞质。在烟草中瞬时表达该效应子能够显著抑制Bax诱导的细胞坏死。利用细菌的Ⅲ型分泌系统在小麦中瞬时表达Pst30,能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧积累减少,菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应子Pst30可抑制寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity, PTI)和ETI(Effectors-triggered immunity, ETI),促进自身的侵染。     

转DsRed荧光蛋白的新月弯孢Curvularia-lunata菌株构建

本研究通过农杆菌介导转化方法(ATMT),利用DsRed荧光蛋白基因对玉米弯孢叶斑病致病菌新月弯孢进行遗传转化。通过转化子的荧光蛋白基因和潮霉素B抗性基因的PCR检测,菌丝体和分生孢子的荧光观察,hyg基因的Southern杂交验证,以及荧光蛋白基因插入位点的TAIL-PCR分析,确定了DsRed荧光蛋白基因插入与表达对新月弯孢转化子的影响。结果表明:测定的4株转化子基因组中均成功整合了DsRed荧光蛋白目的基因片段;转化子在生长发育和致病性方面与野生型菌株存在一定差异,分别有2株在产孢量方面略高于野生型菌株,4株转化子在纤维素酶活性和粗毒素致病力方面均低于野生型菌株,有3株转化子在果胶酶活性上较野生型菌株有提高,1株转化子的致病力显著低于野生型菌株;获得其中3个转化子插入位点的侧翼序列。     

嵌合蛋白MoSlp1-AtCERK1作为抗病激发子的研究

本研究通过DNA体外重组技术,将稻瘟病菌MoSlp1基因和拟南芥几丁质寡糖受体基因AtCERK1的跨膜结构域和胞内结构域基因融合,构成嵌合基因MoSlp1-AtCERK1。在烟草瞬时表达试验中,MoSlp1-AtCERK1嵌合蛋白诱导烟草产生以过敏性坏死为表现形式的过敏反应。以带有MoSlp1-AtCERK1蛋白的农杆菌注射烟草,可增强烟草对烟草花叶病毒的抗病性。同时提高烟草的PR-1基因转录表达水平,表明MoSlp1-AtCERK1嵌合蛋白基因通过水杨酸信号传导的途径激活烟草系统获得性抗病。     

青枯菌GMI1000效应蛋白RipQ对致病力的作用研究

青枯菌通过Ⅲ型分泌系统向寄主植物细胞分泌100多种效应蛋白,对寄主植物的抗感病性产生影响。青枯菌效应蛋白RipQ启动子区存在典型的HrpB识别序列PIP box (5′-TTCGG-N15-TTCGC-3′),但其功能尚未明确。本研究分析了RipQ在青枯菌4种演化型菌株中的分布情况。以青枯菌GMI1000为出发菌,构建ripQ缺失突变体和过表达菌株,研究效应蛋白RipQ在青枯菌-番茄植物互作中的功能。结果显示,ripQ广泛分布于除演化型IV的不同青枯菌类群中。与野生型菌株相比,ripQ突变体在番茄上的致病力有一定程度的增强,而ripQ过表达菌株的致病力显著降低。突变体和过表达菌株在培养基中的生长与野生型没有区别,但过表达菌株在番茄体内的繁殖能力下降。RipQ过表达菌株侵染番茄后hrpB、hrpG和epsA基因表达量显著下调,且能够诱导番茄叶片H₂O₂的大量累积,过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a的诱导表达。另外,在番茄上瞬时表达ripQ也可以观察到H₂O₂积累及叶片细胞坏...     

OsDCL1基因沉默突变体诱导稻瘟病抗性的转录组分析

稻瘟病是严重危害水稻生长的真菌病害,每年给水稻生产带来重大经济损失。与野生型日本晴NPB相比,OsDCL1基因沉默突变体增强了水稻对稻瘟菌的广谱抗病性。为了解水稻OsDCL1-RNAi突变体的抗病机制,我们分析和比较了它和野生型日本晴NPB在稻瘟菌侵染前后转录组水平的变化。响应稻瘟菌侵染的7 129个差异表达基因(DEGs)中,NPB和OsDCL1-RNAi突变体分别有5 382和5 180个基因表达发生了变化,参与生物胁迫反应、信号通路、蛋白代谢和RNA调控4个通路的基因明显被富集。以野生型未受稻瘟菌侵染的基因表达为对照,在OsDCL1-RNAi突变体中共发现1 318个DEGs,且超过70%是上调的,其中很多基因参与了生物胁迫反应(26.9%)和信号通路(11%),上调表达基因中与生物胁迫反应相关的主要为PR基因和细胞壁相关基因。另外,还发现10个茉莉酸相关基因和11个水杨酸相关基因分别在OsDCL1-RNAi突变体中显著下调和上调表达。在OsDCL1-RNAi突变体中还发现WRKY和MYB等一些转录因子家族以及部分受体类激酶被诱导表达。用qRT-PCR方法验证部分差异表达的基因,其结果与DEGs基本一致。OsDCL1-RNAi突变体中转录组变化的分析,为深入了解该突变体抗瘟性增强的机制奠定了基础。     

无毒稻瘟菌株AM16诱导水稻稻瘟病抗性研究

利用病原菌无毒或弱毒菌株诱导植物抗病性是植物病害生物防控的重要研究方向。前期研究中,鉴定了一株对所有测试水稻都不致病的无毒稻瘟菌株AM16。本研究通过AM16菌株与致病稻瘟菌株对峙培养试验结果表明,AM16菌株对致病稻瘟菌株生长无拮抗作用。利用AM16培养液处理水稻幼苗,能显著增强水稻植株的稻瘟病抗性,处理后48～72 h抗性最强。温室和大田试验结果表明,喷施AM16培养液能增强分蘖期和抽穗期水稻植株的抗瘟性,防效在40%以上。进一步研究发现,AM16培养液处理的水稻植株,体内防御相关酶PPO、PAL、SOD、POD、APX和CAT活性有不同程度的上升,SA和JA通路关键基因（Os PAL1、Os NPR1和Os AOS2）和防御相关基因（Os Chit1、OsPR10b、Os PR1a和OsPR1b）表达上调。该研究为AM16菌株在稻瘟病生物防治中的开发利用奠定了重要基础。     

水稻地方品种‘月亮谷’纯系对田间稻瘟病菌的选择

云南元阳哈尼梯田稻作模式是水稻可持续生产模式之一。尽管梯田地理条件适合稻瘟病的发生,但地方品种‘月亮谷’在超百年的种植历史上未有稻瘟病大发生的记载,其原因值得探索。为了解‘月亮谷’不同抗性品系对环境中稻瘟病菌的选择作用,以‘月亮谷’单粒传纯系为材料,通过孢子捕捉法和常规病组织分离法采集稻瘟菌株,进行人工培养、表型观察,接种测定了这些稻瘟菌菌株对25个抗稻瘟病单基因近等基因系的致病型。结果表明,梯田环境空气中采集的稻瘟菌孢子菌落形态呈放射状,菌落疏松,生长在培养基浅表,产孢量总体差异不明显,黑色素颜色较浅;从水稻感病组织上分离到的稻瘟菌菌落呈地毯状,菌落紧密,匍匐在培养基表面,产孢量个体差异较大(P0.05),黑色素颜色较深。测定的稻瘟菌菌株对25个近等基因系都有致病性,联合致病性在12.0%~56.0%之间。来自环境空气中的菌株的平均联合致病性(24.8%)低于分离自‘月亮谷’纯系的菌株(38.4%)。进一步分析显示,稻瘟菌株联合致病性与其菌丝生长速率、产孢量相关性不明显;但与黑色素合成存在一定关联,颜色越深,致病性越强,来源于‘月亮谷’不同品系上的菌株致病性强于环境空气中的菌株。上述结果表明,元阳哈尼梯田环境中的稻瘟菌群体与‘月亮谷’纯系上分离到的稻瘟菌群体存在较大差异。     

转录因子OsEIL2正调控水稻对纹枯病的抗性

纹枯病(sheath blight)是水稻三大病害之一,对水稻产量和品质造成严重影响。基因芯片数据分析发现,水稻受到纹枯病菌侵染时,与拟南芥EIN3同源的基因OsEIL2表达量显著升高,预示OsEIL2与水稻对纹枯病的抗性反应相关。利用农杆菌介导的方法,构建了OsEIL2-RNAi植株,实时荧光定量RT-PCR分析表明,该基因被特异性沉默,接种结果显示,OsEIL2沉默后,水稻对纹枯病菌感病性增强。通过水稻原生质体和烟草亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞核,酵母单杂交结果表明,该基因具有转录激活活性。在OsEIL2-RNAi植株中,乙烯合成关键酶的编码基因OsACO1表达量下降。综上,OsEIL2是一个与拟南芥EIN3蛋白同源的转录因子,能正调控水稻对纹枯病的抗性。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

氮胁迫条件下稻瘟病菌分泌蛋白致病性分析

 以CH-63和TH-162个致病性差异的稻瘟病菌株为材料,在缺氮培养条件下进行液体培养。经培养2 d后,采用铵盐沉淀及透析纯化处理获得稻瘟病菌培养滤液中的分泌蛋白。分别采用致伤接种及浸泡处理对该蛋白作用水稻植株后的病理反应进行系统研究,结果表明经致伤接种的水稻叶片及茎杆接种斑处出现明显的坏死病斑,其病斑直径是对照的2~4倍。浸泡处理的水稻幼根出现严重褐化,植株生长矮小,株高仅为对照的1/2。对上述稻瘟病菌株分泌蛋白进行酶解处理后病症消失或减弱,进一步确证其为引起上述病理反应的主要因子。将该分泌蛋白接种24个水稻单基因系,接种后72 h根据病斑长度将24个IRRI水稻单基因系按抗、中、感病性状分组。对稻瘟病菌菌株CH-63和TH-16的缺氮分泌蛋白致病力强弱差异与菌丝块接种结果进行比较,结果表明CH-63致病力强于TH-16。