小檗内生放线菌H21的鉴定及抑菌活性成分分析

【目的】从药用植物小檗（Berberis thunbergii）中筛选抗菌活性内生放线菌,对活性菌株的分类地位及抑菌活性进行研究,分离并鉴定候选菌株发酵液中活性成分的化学结构及其抑菌活性,为农用杀菌剂的创制提供依据。【方法】采用选择性培养基从小檗叶片分离内生放线菌,16S rDNA法进行菌株鉴定;采用管碟法测定发酵液对烟草青枯病菌 （Ralstonia solanacearum）等7种供试菌的抗细菌活性,采用抑制菌丝生长速率法测定发酵液对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等7种植物致病菌的抗真菌活性;依次采用大孔树脂吸附、硅胶柱层析及反相高效液相色谱（HPLC）等技术分离纯化活性组分;采用核磁共振波谱（NMR）和质谱（MS）技术对分离到的活性成分进行结构鉴定;采用微量肉汤稀释法测定化合物对烟草青枯病菌等7种细菌的最低抑菌浓度,抑制孢子萌发法和菌丝生长速率法测定化合物对番茄灰霉病菌的抗菌活性。【结果】分离到一株活性菌株H21,该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为链霉菌（Streptomyces sp.）;除铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外,H21菌株发酵液对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）等多种病原细菌有明显的抑菌活性;H21发酵液对番茄灰霉病菌表现出较强的抑制菌丝生长作用,对其他供试病原真菌无明显的抑菌活性;从H21菌株发酵液中分离鉴定了3个化合物,分别为N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺、环-（L-亮氨酸-L-精氨酸）和二硫吡咯类抗生素-全霉素;全霉素为广谱抗生素,其对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.156、0.313、0.078、0.313、0.156和0.313 µg·mL^-1;对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑菌中浓度（IC₅₀）分别为13.56和7.89 µg·mL^-1。【结论】小檗内生菌放线菌H21可能是一种新的全霉素产生菌,其对植物致病细菌烟草青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌有抗菌活性,全霉素对于开发针对致病细菌的农用杀菌剂具有重要的参考价值。     

凤县几种野生植物内生放线菌的分离筛选

用选择性培养基从采自凤县的12种野生植物中分离获得15种放线菌.非寄主作物定殖试验表明分离所获放线菌不仅能够定殖在不同植物体内,而且能定殖在植物的不同部位,具有内生性;皿内拮抗试验结果表明,15株内生放线菌中有2株对5种供试靶标真菌（梨状毛霉菌、西瓜枯萎菌、番茄灰霉菌、粉红聚端孢、苹果炭疽菌）有明显拮抗活性,其中Am3对灰葡萄孢菌抑制率达89.0%.Am5对西瓜枯萎病菌抑制率达81.0%;2株内生放线菌的发酵液对供试靶标真菌也有明显抑制作用,菌体残渣提取物的拮抗活性明显高于发酵滤液提取物.温室番茄、黄瓜防病促生实验结果显示菌株Am3、Am5有较好的防病促生作用,其中经Am3处理过的番茄植株干重比对照植株干重增加120%,对番茄灰霉病的防效达68.9%.     

鱼腥草内生放线菌的分离及杀菌活性研究

[目的]探索鱼腥草内生放线菌的杀菌生物活性。[方法]以新鲜鱼腥草为材料,从其根、茎和叶部共分离得到7株内生放线菌。采用抑制菌丝生长速率法和抑制孢子萌发法对7株内生菌发酵产物进行杀菌活性筛选。[结果]这7株内生放线菌均具有一定抑制活性。其中,编号为K3和K15的2株内生菌发酵液对玉米纹枯病菌、玉米小斑病菌、黄瓜枯萎病菌和禾谷镰刀菌等4种植物病原真菌均有较强抑菌活性,其抑制率均在70%以上,对玉米小班病菌孢子萌发的抑制率在90%以上。进一步研究K15和K3菌株的抑菌活性可知,K15和K3菌株发酵液对玉米小斑病菌的孢子萌发的EC50值分别为3.71和14.97 mg/ml;盆栽和田间试验结果均表明K15和K3菌株发酵液对小麦白粉病有较好的防治效果,对小麦白粉病的盆栽保护和治疗效果均高于70%,田间防治效果分别为77.46%和66.55%。[结论]K15和K3菌株发酵产物具有广谱的杀菌活性,特别对小麦白粉病菌有很好的田间防治效果。     

黄瓜内生放线菌Hhs.015发酵液抑菌活性成分的研究

为了明确放线菌Hhs.015发酵液中的抑菌活性成分,试验采用硅胶柱层析和凝胶柱层析等分离手段,以苹果树腐烂病菌为靶标菌进行活性跟踪,对发酵液中抑菌活性成分进行提取、分离和纯化,得到2种活性物质。采用ESI-MS、NMR等对活性物质进行结构解析,确定化合物为苯乙酸和染料木素。对苯乙酸和染料木素分别进行抑菌活性测定,结果表明,苯乙酸对苹果树腐烂病菌、小麦全蚀病菌和小麦纹枯病菌具有明显抑制作用,其EC_(50)分别为57.21,166.92和238.23μg/mL,。就对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制作用而言,苯乙酸(EC_(50)=57.21μg/mL)优于市售药剂70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(EC_(50)=154.39μg/mL),因此与阳性对照相比,苯乙酸尚具有一定的开发应用前景。染料木素对玉米大斑病菌和番茄早疫病菌具有抑制作用,其EC_(50)分别为522.40和311.53μg/mL,。利用HPLC方法测定了苯乙酸在发酵过程中的含量变化,发现发酵5 d时发酵液中苯乙酸含量较高。以上结果明确了放线菌Hhs.015发酵液中的部分抑菌活性物质及其抑菌效果,为后续研究提供了参考。     

特殊生境中植物枯、黄萎病拮抗放线菌的筛选及鉴定

【目的】从特殊生境中分离筛选对植物枯、黄萎病具有较高生防活性的土壤放线菌,为深入开展枯、黄萎病的生物防治提供高效菌株。【方法】用平板稀释法,从采自广西、江苏、陕西等地特殊生境的5份土壤样品中分离放线菌;以西瓜枯萎菌、茄子黄萎菌、棉花枯萎菌作为靶标菌,通过平板对峙法进行初筛和复筛;采用菌丝生长速率法、水琼脂平板法,测定入选菌株发酵液的活性,并对其中拮抗活性高的菌株进行形态特征、培养特征及生理生化特性的分析鉴定,初步确定其分类地位。【结果】从5份采自特殊生境的土壤样品中共分离出53株放线菌,并从中筛选出JSC14、GXW1、GXC1、JSW5、JSW7等5株对所有靶标菌都有明显拮抗效果的菌株,其中JSC14菌株发酵液抑菌作用最强。对5株菌发酵液抑菌活性的测定结果表明,JSC14和GXW1菌株发酵液对供试病原菌菌丝生长和孢子萌发均有强烈的抑制作用,菌丝生长抑制率为62.98%～95.38%,孢子萌发抑制率为69.52%～100.0%。经初步鉴定,菌株JSC14为链霉菌属白孢类群白色亚群白色链霉菌(Streptomyces albus),菌株GXW1为拟诺卡氏菌属链孢拟诺卡氏菌(Nocardiopsis streptosporus)。【结论】获得2株对植物枯、黄萎菌有较高生防活性的土壤放线菌,为进一步探讨利用特殊生境中的放线菌控制土传病害提供了研究材料。     

冬青卫矛内生真菌2QR1菌株代谢产物的杀菌活性

为寻找天然植物源新的具有农药活性的先导化合物,从冬青卫矛根皮中分离到1株内生真菌,编号为2QR1,初步鉴定其为半知菌亚门,曲霉属(Aspergillus)。室内活性测定结果表明,2QR1菌株发酵液的杀菌活性远高于菌丝体的杀菌活性。该菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌、番茄叶霉病菌、烟草赤星病菌和马铃薯干腐病菌菌丝生长抑制的有效中质量浓度EC50值分别为53.6,63.1,63.3,98.2,106.5,115.9和166.3μg/mL;对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌、烟草赤星病菌和马铃薯干腐病菌抑制孢子萌发的有效中质量浓度EC50值分别为94.8,139.1,146.6和180.1μg/mL;在质量浓度为500μg/mL时,对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在16 mm以上。盆栽试验结果表明,2QR1菌株发酵液乙酸乙酯萃取物在质量浓度为2 000μg/mL时,对小麦白粉病的保护作用和治疗作用分别为61.9%和81.6%。选用硅胶柱层析,以杀菌活性追踪为指导,对该菌株发酵液乙酸乙酯萃取物进行了杀菌活性成分的分离,得到化合物B9。化合物B9对玉米大斑病菌、烟草赤星病菌、小麦根腐病菌和马铃薯干腐病菌抑制孢子萌发的有效中质量浓度EC50值分别为0.8,1.4,3.3和5.0μg/mL。     

4株放线菌的防病促生作用研究

从分离的54株放线菌中筛选出具有很强抑菌活性的4株放线菌（05-5、05-11、05-25和06-6）进行发酵液活性试验,结果表明,菌株06-6的发酵液对4种靶标菌的抑菌活性较强,抑菌圈直径均大于20 mm.温室试验中4株放线菌对番茄灰霉病均有不同程度的防治效果,以菌株06-6表现最为明显,防效达到了81.2%.4株放线菌对番茄幼苗的生长有明显的促进作用,与对照相比,菌株06-6使番茄幼苗的株高增幅达到68.3%.     

生防放线菌发酵液诱导黄芩对其防御酶系的影响

在高氏1号培养基中加入质量浓度为50μg/mL的化学抑制剂K2Cr2O7,用抑菌圈法从陕西省商州区土壤样品中筛选出8株放线菌,其中MⅠ2菌株对黄芩根腐病菌的抑制率最大(31.27%),可见MⅠ2菌株的生防效果最强。用放线菌MⅠ2发酵液诱导处理黄芩幼苗,测定在不同生长期黄芩叶片中防御酶系活性的变化。结果表明:MⅠ2菌株发酵液处理黄芩与CK相比,均能引起黄芩体内防御酶发生明显变化,过氧化氢酶(CAT)的活性受到抑制,过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均有所提高。CAT和POD活性以发酵液原液的作用效果最为显著,而PAL活性以发酵液稀释20倍的作用效果最为明显。放线菌MⅠ2菌株发酵液诱导黄芩使其防御酶系活性发生变化而提高植株的抗病性。     

生防放线菌发酵液诱导黄芩对其防御酶系的影响

在高氏1号培养基中加入质量浓度为50μg/mL的化学抑制剂K2Cr2O7,用抑菌圈法从陕西省商州区土壤样品中筛选出8株放线菌,其中MⅠ2菌株对黄芩根腐病菌的抑制率最大(31.27%),可见MⅠ2菌株的生防效果最强。用放线菌MⅠ2发酵液诱导处理黄芩幼苗,测定在不同生长期黄芩叶片中防御酶系活性的变化。结果表明:MⅠ2菌株发酵液处理黄芩与CK相比,均能引起黄芩体内防御酶发生明显变化,过氧化氢酶(CAT)的活性受到抑制,过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均有所提高。CAT和POD活性以发酵液原液的作用效果最为显著,而PAL活性以发酵液稀释20倍的作用效果最为明显。放线菌MⅠ2菌株发酵液诱导黄芩使其防御酶系活性发生变化而提高植株的抗病性。     

放线菌CCTCC M207210所产青霉抑制物的稳定性及应用

 【目的】明确放线菌CCTCC M207210发酵液的青霉抑制活性在不同处理条件下的稳定性,评价其在苹果贮藏与果汁加工中的应用潜力。【方法】将无菌体发酵液经热、酸、碱、紫外线等处理不同时间后,用滤纸片法在琼脂平板培养基上检验发酵液对产展青霉素扩展青霉SP2204、SP2205生长的抑制活性;在接种扩展青霉的苹果和苹果汁上喷涂或加入无菌体发酵液,分别培养12和7 d后,测定苹果的病斑直径和果汁中展青霉素产量。【结果】加热、酸碱处理和紫外线照射都会破坏发酵液对扩展青霉生长的抑制活性：经100℃保温处理60 min,或紫外线照射（30 W,245 nm,15 cm）90 min,发酵液的抑菌活性完全丧失;发酵液的抑菌活性在发酵液原始pH(5.7)下最稳定,偏碱性条件的稳定性稍高于偏酸性条件。接种扩展青霉120 h后,在苹果表面喷涂无菌体发酵液可使苹果病斑直径的扩展速度降低25%;在果汁中加入40%（v/v）的无菌体发酵液,可使展青霉素产量降低90%。【结论】放线菌CCTCC M207210发酵液对扩展青霉的抑菌活性具有一定的热、酸碱和紫外线耐受能力,在苹果贮藏和果汁加工中抑制扩展青霉素的生长与产毒方面有一定应用潜力。     

提高小麦叶枯菌筛选敏感度的方法

为了提高先导化合物杀菌活性筛选敏感度,选用小麦叶枯菌(Mycosphaerella graminicola)作为供试靶标,比较了半固体法杀菌活性筛选中的不同单孢子纯培养对标准样品杀菌活性的敏感度。结果表明,小麦叶枯菌不同单孢子纯培养,对标准样品的敏感度差异显著。基于以上结果,使用微生物源发酵提取物对敏感的单孢子纯培养和对照培养物进行了验证筛选。结果表明,对1 920个样品的筛选中,敏感的单孢子纯培养比对照培养物的活性样品检出率提高2.24%,活性样品检出数量增加54.43%。     

云南榧内生放线菌FTY2的分子鉴定及其抑菌活性

为探明菌株FTY2的分类地位及其发酵液的抑菌活性,采用改进的CTAB法和抑制菌丝生长速率法对从云南榧新鲜茎叶上分离得到的1株内生放线菌FTY2进行分子鉴定及其发酵液的抑菌活性研究。结果表明:FTY2初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)放线菌,其发酵液对小麦雪腐病菌、油菜菌核病菌、淡色生赤壳菌、腐皮镰刀菌、尖孢炭疽菌和水稻稻瘟病菌等6株植物病原真菌的EC50分别为5.90mL/L、9.48mL/L、11.56mL/L、227.19mL/L、12.35mL/L和61.87mL/L;在121℃下处理30min后,对尖孢炭疽菌的抑菌活性开始大幅下降,抑制率从93.79%(4℃)降至26.73%(121℃);不同pH处理发酵液的抑菌率基本不变,均达92%以上。     

94株土壤放线菌抑菌活性的初步筛选

以油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌为指示菌,采用生长速率法对94株土壤放线菌进行抑菌活性筛选。发现AXW4-1菌株等10株放线菌发酵液至少对3种病原真菌中的1种有60%以上的抑制率,占总测试菌株的10.64%。对这10株放线菌进行抑制孢子及菌核萌发试验,结果获得4株活性较高的菌株,其中AXW4-1和HVA29-2菌株发酵液对番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制率分别为86.9%和78.8%,X-1-8和GSA26-2菌株发酵液10倍稀释液对油菜菌核病菌的菌核萌发抑制率均为86.1%;油菜叶片组织法试验表明,X-1-8和GSA26-2菌株发酵液对油菜菌核病的药效均在90%以上。     

土壤拮抗放线菌S-5210-6的筛选及其初步分类鉴定

从秦岭山区不同海拔、不同植被类型土壤中分离出750株放线菌,对其进行皿内琼脂平板、放线菌发酵液及拮抗菌单胞菌的拮抗性筛选。结果表明,S 5210 6号菌株对稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicumleonard)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerium)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)、番茄早疫病菌(Altermariasolani)、小麦白粉病菌(Erysiphegraminis)8种供试病原真菌具有强烈的拮抗和溶菌作用,根据其形态特征、培养特征、生理生化特征及细胞壁化学成分分析,确定其归属于链霉菌属(Streptomyces)。     

土壤拮抗放线菌S-5210-6的筛选及其初步分类鉴定

从秦岭山区不同海拔、不同植被类型土壤中分离出750株放线菌,对其进行皿内琼脂平板、放线菌发酵液及拮抗菌单胞菌的拮抗性筛选。结果表明,S 5210 6号菌株对稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicumleonard)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerium)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)、番茄早疫病菌(Altermariasolani)、小麦白粉病菌(Erysiphegraminis)8种供试病原真菌具有强烈的拮抗和溶菌作用,根据其形态特征、培养特征、生理生化特征及细胞壁化学成分分析,确定其归属于链霉菌属(Streptomyces)。     

放线菌菌株1a发酵液抗菌谱及抗菌物质稳定性研究

采用琼脂扩散法对放线菌菌株1 a发酵液进行了抗菌谱测定。结果表明,菌株1 a发酵液对9种常见植物病原真菌有很好的抑制作用,其中对人参锈腐菌抑菌活性最强,抑菌圈直径可达22 mm。稳定性测定结果表明菌株1 a发酵液低温贮藏效果好,对热及紫外光照稳定性较强,对极端酸碱环境稳定性较差。     

稗子用于微生物源生物除草剂筛选的研究

以马唐[Digitaria sanguinalis(L.)Scop.]作为参照靶标,使用水琼脂表面涂布微孔板法及小型盆栽法对稗子[Echinochloa crusgalli(L.)Beauv]的筛选敏感性进行试验。使用微孔板法对化学除草剂标准样品、真菌及放线菌除草剂标准菌株的发酵液进行了除草活性比较;使用小型盆栽法对真菌及放线菌除草剂标准菌株的发酵液进行了除草活性比较。结果表明,微孔板法中稗子的敏感性差,尤其不适用于针对稗子的微生物源生物除草筛选;小型盆栽法中稗子与马唐的敏感度相近,适用于针对稗子的微生物源除草筛选,具有稳定高、抗杂菌污染强、操作简单等突出优点;针对稗子用于除草剂筛选中敏感性低的缺点可以通过选择适当苗龄的方法加以优化。     

拮抗放线菌ZZ-9菌株发酵液的抑菌谱及稳定性测定

为探究拮抗放线菌ZZ-9(Streptomyces rochei)菌株发酵液的抑菌谱,并明确传代培养、温度、光照、pH及紫外线等理化因素对发酵液稳定性的影响。以15种植物病原真菌为供试菌,采用菌丝生长速率法测定发酵液的抑菌谱,并以苹果树腐烂病菌(Cytosporasp.)为指示菌,测定不同条件下发酵液的稳定性。抑菌谱结果表明:ZZ-9菌株发酵液对供试的15种病原真菌均具有不同程度的抑制作用,其中对苹果树腐烂病菌和立枯丝核菌抑制效果最好,生长抑制率可达96%以上,且效果持久;而对苹果轮纹病菌、蚕豆褐斑病菌、月季叶霉病菌等抑制效果较差,抑制率在27%以下。稳定性试验结果表明:菌株传接6代时,活性稳定,从第7代开始菌株活性下降显著;发酵液耐高温,对强酸强碱处理、可见光及紫外线照射均有较好的稳定性;且在4℃及室温(20~25℃)下可贮藏至少30d而保持其抑菌活性几乎不变。因此,拮抗放线菌ZZ-9菌株次生代谢产物具有较广谱的抑菌活性和较强的稳定性,具有开发成微生物农药的潜力。     

蜈蚣草内生菌分离筛选及发酵液的抑菌活性

为从蜈蚣草(Pteris Vittata L.)中筛选出具有农用价值的生防菌,同时为获得抑菌高活性化合物奠定基础,采用组织表面消毒法从蜈蚣草中分离内生真菌,并测定其对10种靶标菌(香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、香蕉枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、橡胶落叶棒孢霉、椰子灰斑病菌、水稻纹枯病菌、橡胶黑团孢病菌、番茄早疫病菌)的拮抗作用和不同有机溶剂(石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇)萃取相的抑菌活性和毒力。结果表明:采用组织表面消毒法从蜈蚣草中分离获得10株内生真菌,其中内生真菌WGCY1的抑菌谱较广,对10种靶标菌的抑菌率均超过50%,尤其对香蕉炭疽菌的抑菌率高达86%;WGCY1发酵液正丁醇萃取相表现出较好的抑菌活性,对香蕉炭疽病菌的抑菌活性最高,EC50仅0.040mg/mL。     

放线菌Y23菌株发酵液抗菌活性及稳定性测定

从山东临沂、日照等主产烟区烟田采集病株根际土壤,分离到一株有抗菌活性的放线菌Y23,经初步鉴定为链霉菌（streptomyces sp．）。分别采用抑制菌丝生长速率法和琼脂扩散法测定了Y23菌株发酵液对15种病原真菌、3种病原细菌的抗菌活性。结果表明,Y23菌株发酵液对3种供试真菌的菌丝生长抑制率达60％左右,占供试真菌数的20％;琼脂扩散法生测结果表明,Y23菌株发酵液只对布克氏杆菌有抑制作用。对Y23菌株发酵液的稳定性测定结果表明,发酵液低温贮藏效果好,对热、酸碱及紫外光照稳定性较强,对日光稳定性较差。