金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因（fnbA）序列设计了1对特异性引物，以金黄色葡萄球茵基因组DNA为模板，进行PCR扩增；结果获得了3600bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM T easy载体中，成功地构建了克隆质粒pGEM—fnbA。以HindⅢ和XhoⅠ双酶切pGEM-fnbA和pET28a（＋），将纯化的基因fnbA亚克隆至pET28a（＋）中，构建了原核表达质粒pET28a-fnbA，并将其转化至E．coli BL21（DE3）感受态细胞中，经1mmol／LIPTG诱导和SDSPAGE分析，在约165ku处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。Western—blotting分析表明，该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。     

葡萄球菌肠毒素C基因的克隆表达及其生物学活性鉴定

为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法.此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性.结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础.     

金黄色葡萄球菌ClfA基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中ClfA基因序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得了约2 300 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建了克隆质粒pMD18-ClfA.用BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切pMD18-ClfA和pET28a(+),将纯化的基因ClfA亚克隆至pET28a(+),构建重组质粒pET28a-ClfA,并将其转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在87 000处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.     

金黄色葡萄球菌FnBA活性基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.     

金黄色葡萄球菌IsdE基因的克隆与表达

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种能够引起人和动物发病的重要致病菌,广泛分布于自然界中,如空气、土壤、水及物品上,也经常存在于人和动物的皮肤以及与外界相通的腔道中[1]。金黄色葡萄球菌通过产生多种毒力因子导致机体发病,并且致病力较强[2],给金黄色葡萄球菌性疾病的预防和     

金黄色葡萄球菌FnBPA D基因片段的表达

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要传染性病原菌.本实验采用分子克隆及蛋白表达技术,成功的表达了金黄色葡萄球菌纤维素结合蛋白A(FnBPA)D片段并对其免疫学活性进行了初步研究.表达产物免疫实验动物后,获得较高效价的抗体.用制备血清进行吞噬调理试验,抗金黄色葡萄球菌黏附等一系列试验,证明 抗体对金黄色葡萄球菌具有吞噬调理作用,也有抗金黄色葡萄球菌黏附的作用,这将为制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌黏附素疫苗奠定基础.     

牛乳源性金黄色葡萄球菌nEBPS蛋白表达鉴定及多克隆抗体制备

利用PCR方法扩增乳源致病性金黄色葡萄球菌nEBPS全基因,将其定向克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得了以可溶性表达的重组蛋白。通过NiNTAPurificationSystem纯化重组蛋白,纯化蛋白质量浓度为2．16g／L。纯化蛋白经免疫印迹检测显示重组蛋白能够被牛源金黄色葡萄球菌阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接EI,1SA测定抗体效价为1：25600,凝集试验测定抗体效价为1：128。     

金黄色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆及原核表达载体的构建

根据GenBank中的金黄色葡萄球菌β-溶血素（hlb）基因序列,设计合成1对引物,采用PCR方法扩增出与预期设计大小相符的hlb基因特异性条带,将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化感受态细胞,经平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒,对重组质粒进行序列测定,结果表明：金黄色葡萄球菌β-溶血素基因全长982bp,不含终止密码子的目的基因,插入的位点、大小与读码框均正确。将hlb基因插入到原核表达pET-32a中,转化到BL-21感受态细胞中,获得了表达hlb基因的阳性重组质粒。     

奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达

以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆栽体pMD18-T相连接.测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%.构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57 000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达.     

金黄色葡萄球菌氟喹诺酮耐药性与NorA基因mRNA表达水平的关系

提取金黄色葡萄球菌的总RNA，应用荧光定量RT-PCR对多药耐药转运蛋白NorA基因mRNA表达水平进行定量检测的结果表明：中度耐药（CIP）的菌株（4mg／L≤MIC≤64mg／L）NorA基因mRNA表达水平为敏感菌株的5～17倍．强耐药菌株（MIC≥128mg／L）为敏感菌的1～2倍。     

金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps抗原表位的串联表达及多克隆抗体的制备

为获得金黄色葡萄球菌特异性抗原蛋白并以此制备多克隆抗体,应用DNAStar软件筛选金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps的抗原表位,以柔性氨基酸序列连接后进行全基因合成,将目的基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞,诱导表达,采用Sepharose 4B柱亲和层析纯化表达蛋白,制备抗原后对家兔进行皮下多点注射,于第42天采集外周血,获得血清。结果表明,本试验成功构建了金黄色葡萄球菌抗原基因表达载体,并获得了高免血清,经ELISA的方法检测血清效价可达到1∶10000以上,成功制备多克隆抗体,为以后采用免疫学方法快速检测金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定

本研究从福建省某养殖场病兔分离到3株革兰氏阳性球菌,并对其进行了16S rRNA扩增、生化反应、药敏试验等检测,结果显示该病原菌为金黄色葡萄球菌。     

金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的分离鉴定和最佳保存方法研究

基于细菌rRNA区域序列的PCR技术,通过设计特异性引物从奶样中快速、准确地鉴定奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌。采用金黄色葡萄球菌与挤奶前从奶牛乳房上洗刷下来的污水经过3次富集的方法,通过双层琼脂平板法,分离纯化得到了强裂解性的奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌的噬菌体。本试验分离的是可收缩尾的噬菌体,其头部为二十面体,约50 nm×62.5 nm,尾部长约187.5 nm,尾宽约37.5 nm,有尾鞘、基板等结构。纯化后在双层琼脂平板上形成的噬菌斑大而整齐,边缘光滑,透明,直径约2 mm,具有明显的强裂解性噬菌体特性,通过测定,该噬菌体的最佳感染复数为0.01,效价大于10⁹ PFU/mL。对噬菌体的不同保存方法进行比较,结果表明,将噬菌体置于-80 ℃加入7% DMSO冷藏是较好的保存方法。     

白绒山羊PH-30基因的克隆及表达

PH-30是参与精卵质膜间相互作用中最有特征性的候选分子之一。为了检测PH-30基因在白绒山羊睾丸中特异表达情况,试验提取公山羊睾丸组织总RNA,反转录合成cDNA,并根据GenBank中公布的3种动物PH-30 cDNA序列的保守区设计1对引物,PCR扩增后纯化回收目的片段,连接pGM-T载体,挑取阳性克隆进行测序,经序列分析鉴定目的片段。结果表明,PCR扩增获得448 bp目的片段,与绵羊PH-30同源性99%,与牛PH-30的同源性为92%。多组织的RT-PCR研究结果表明,该基因只有在白绒山羊睾丸组织中特异性表达,而在其附睾头、体、尾部组织中没有表达。     

牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测

本研究旨在了解甘肃地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药性和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染情况,为奶牛乳房炎的防制提供理论依据。采用KB纸片扩散法,检测17株金黄色葡萄球菌对8种不同抗菌药物的敏感性;再用琼脂稀释法检测了苯唑西林、万古霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MICs);头孢西丁纸片扩散法和PCR扩增特异性mecA耐药基因对所有受试菌株进行全面的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测。结果表明,菌株对青霉素、磺胺异恶唑具有较强抗性,而对环丙沙星、头孢唑啉、万古霉素和苯唑西林全敏感;头孢西丁纸片扩散法未能检测出表型为MRSA的阳性菌株,而PCR方法却检测出8株mecA基因阳性菌株,且这些菌株的苯唑西林MIC均小于2 μg/mL。菌株的耐药情况较严重,对甲氧西林敏感而携带mecA基因的菌株高频存在于被调查地区的奶牛场中。     

Expression and lytic efficacy assessment of the Staphylococcus aureus phage SA4 lysin gene

Treatment of bovine mastitis caused by Staphylococcus (S.) aureus is becoming very difficult due to the emergence of multidrug-resistant strains. Hence, the search for novel therapeutic alternatives has become of great importance. Consequently, bacteriophages and their endolysins have been identified as potential therapeutic alternatives to antibiotic therapy against S. aureus. In the present study, the gene encoding lysin (LysSA4) in S. aureus phage SA4 was cloned and the nucleotide sequence was determined. Sequence analysis of the recombinant clone revealed a single 802-bp open reading frame encoding a partial protein with a calculated mass of 30 kDa. Results of this analysis also indicated that the LysSA4 sequence shared a high homology with endolysin of the GH15 phage and other reported phages. The LysSA4 gene of the SA4 phage was subsequently expressed in Escherichia coli. Recombinant LysSA4 induced the lysis of host bacteria in a spot inoculation test, indicating that the protein was expressed and functionally active. Furthermore, recombinant lysin was found to have lytic activity, albeit a low level, against mastitogenic Staphylococcus isolates of bovine origin. Data from the current study can be used to develop therapeutic tools for treating diseases caused by drug-resistant S. aureus strains.     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体裂解酶LysIMEP5基因的克隆及序列分析

为了克隆奶牛乳房炎金黄色(葡萄球菌裂解性噬菌体裂解酶Lys IMEP5基因,分析其生物信息学特性,以本实验室分离的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体v B_Sau S_IMEP5为材料,根据其全基因组学信息,获取裂解酶基因序列,应用Primer 5.0设计特异性引物。采用PCR方法扩增并克隆Lys IMEP5基因,通过BLAST进行序列比对分析,利用在线软件对蛋白结构进行预测。成功克隆到裂解酶Lys IMEP5基因,测序结果通过DNAMAN比对与原序列完全匹配,无任何基因突变,同源性分析显示,与已报道的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶相似性最高为83.1%;裂解酶Lys IMEP5基因序列全长1371 bp,共编码456个氨基酸,为亲水性蛋白,分子质量为51.717 k Da,理论等电点为9.70;Lys IMEP5同时存在CHAP片段和Amidase-3片段;该蛋白无跨膜区,无信号肽,以无规则卷曲为主。从奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体中成功克隆出Lys IMEP5基因,通过对该蛋白的结构预测分析为后续克隆表达及开发新型绿色抑菌剂奠定了基础。     

Phenotypic and genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolated from raw camel milk samples

In the present study 320 milk samples collected from 160 apparently healthy camels of three different locations in Sudan were investigated for the presence of Staphylococcus aureus resulting in the isolation of this bacterial pathogen from 28 milk samples from 24 camels. Twenty-five S. aureus were identified phenotypically and by PCR mediated amplification of species-specific genes or gene segments. Investigation of the S. aureus for toxinogenic potential revealed that three S. aureus strains were positive for the enterotoxin encoding gene sec and the genes seg, sei, sem, sen and seo, representing the egc gene cluster. In addition all 25 S. aureus were positive for the superantigen-like encoding gene ssl7 (set1). Partial sequencing of gene sec of the three S. aureus strains yielded an almost complete sequence identity to the sequence of the sec variant sec2. However, all three sec2 genes of the present study showed a deletion of one base causing a frame shift and a corresponding earlier stop codon.According to the present results, the raw camel milk collected from three locations in Sudan seems to be, at least at this stage, of minor importance as vector causing staphylococcal food poisoning.