黑龙江凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定

黑龙江凉水自然保护区是我国现有保存下来的较大片原始红松林基地之一,总面积6394hm^2,森林覆盖率95％以上。本研究从小兴安岭凉水自然保护区采集土样782份,采用醋酸钠培养基结合高温方法筛选土壤中的芽孢杆菌,通过光学显微镜观察鉴定产生伴胞晶体的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis．Bt）。总计分离得到芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌分别为1735株和33株,Bt菌株的分离率和出菌率分别为1．90％和4．22％。利用SDS-PAGE和PCR—RFLP方法对筛选获得的成分离株进行了杀虫晶体蛋白和基因型分析,结果表明14株产菱形伴胞的＆菌株,SDS-PAGE电泳分析芽孢后期产生分子量大小130kD蛋白带,PCR-RFLP分析初步鉴定为crylAc基因,其它产圆形或其它不定形晶体蛋白的＆分离菌中,芽孢后期主要蛋白大小为20～150kD不等,PCR—RFLP方法鉴定结合PCR片段测序分析这些菌株含有新型cry4、cry39和cry40基因等。本研究是“中国助资源收鉴与利用”项目组成部分之一,凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定目的是要对整个东北地区成资源分布和多样性作一个初步评估,实验结果表明东北森林地区具有丰富多样的威菌株和杀虫基因资源。     

苏云金芽孢杆菌S1478—1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的＆菌株S1478～1进行了特性鉴定,研究表明S1478—1分离株菌落形态和生长特征和励参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明,S1478—1分离株与其它＆thuringiensis、B．cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99％。分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478—1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50值高达5．159×10^8cfu／mL。初步显示S1478—1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR—RFLP方法鉴定S1478—1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133．3kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99％同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。     

海南岛热带雨林区芽孢杆菌收集及Bt菌鉴定

本研究系统地对海南岛热带雨林自然保护区进行了土壤样品的采集、芽孢杆菌的分离收集和Bt菌株的鉴定。从尖峰岭热带雨林区、五指山热带雨林区、吊罗山热带雨林区、霸王岭热带雨林区总共采集了土壤样品1882份,采用醋酸钠培养基结合高温方法分离出芽孢杆菌3924份,鉴定出Bt分离株158份,Bt菌株的分离率和出菌率分别为4.03％和8.40％。结果分析表明,海南岛热带雨林区芽孢杆菌及Bt菌株分布对环境和生态表现出一定的规律性,一般海拔900m至1400m的反菌株含量高、植被覆盖率高,土壤腐殖质含量高的热带沟谷雨林带眈菌株含量最高。显微观察发现,获得的Bt菌株其伴胞晶体有菱形、球形、方形、椭球形、不定性等多种形状。利用SDS-PAGE方法对获得的Bt分离株进行了伴胞晶体进行分析,发现伴胞晶体的分子量有20kD到150kD不等。进一步利用PCR-RFLP技术对Bt分离株进行了cry基因型的分析,初步发现这些Bt菌株含有cry1、cry3、cry4、cry6、cry30、cry40等基因型。我们还利用鳞翅目昆虫小菜蛾和鞘翅目昆虫椰心叶甲进行部分Bt分离株的生物测定,初步结果显示本研究鉴定出的Bt分离株具有不同的抗虫靶标,对同一靶标昆虫也表现出不同的杀虫活性。整体而言,本研究结果显示出海南岛热带热带雨林自然保护区因其独特的热带地理生境、自然的生物演化系统,使得热带雨林区蕴藏了Bt菌株资源多样化,值得期待挖掘出一些新的菌株和新的基因资源。     

酒糟和窖泥中苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

从泸州老窖酒厂的酒糟和窖泥中采集的168个样品中分离出苏云金芽孢杆菌1株,经光学显微镜观察伴孢晶体形态为菱形。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry5、cry6、cry8、cry4/10、cry11、cry1Ⅰ的引物做PCR分析进行基因型鉴定,发现该分离株有cry1基因。同时还对该株蛋白质图谱和杀虫活性等特性分析,结果表明该分离株对小菜蛾有一定活性,死亡率可达80%,但该菌株对致倦库蚊无活性。     

煤矿中苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株的分离及其鉴定

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种已被广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原细菌。本研究从永春天湖山矿区采集的159份样品中分离出1株Bt,光学显微镜检测发现菱形伴孢晶体。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8、cry11和cry1I的通用引物对该Bt分离菌进行Cry毒素基因分析,利用SDS-PAGE和双向电泳-质谱法(2-dimensional electrophoresis/mass spectrometry,2-DE/MS)对Bt分离菌进行蛋白鉴定。结果表明,分离菌含有cry1基因型,经克隆、测序后可知,菌株中的cry1亚基因型与cry1Ac有极高的同源性。分离株表达的晶体蛋白约为130 k D,通过蛋白质谱分析表明,杀虫蛋白为Cry1Ac,与PCR-RFLP所得出的结果一致;通过质谱分析还鉴定出分子伴侣Gro EL、F0F1型ATP-β亚基合成酶、延伸因子Tu和丙酮酸脱氢酶。生物信息学分析结果表明,这些蛋白主要参与帮助新生肽的正确折叠、能源生产和转换,以及提高细胞的应激能力以抵御外界不良刺激。本研究从煤矿中分离鉴定出Bt菌,为发现新资源、新型杀虫蛋白基因以及利用微生物治理重金属污染提供基础资料。     

一株对马铃薯瓢虫幼虫有特异活性的苏云金芽孢杆菌新菌株的研究

苏云金芽孢杆菌WZ-9是本室从河北省土壤中分离的对马铃薯瓢虫的幼虫有特异杀虫活性的新菌株，本文对该菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等方面进行了研究。结果表明该菌株可产生菱形伴孢晶体，SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa，生长周期是24h，随菌株的生长培养基pH值发生变化；生物活性测定表明该菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72h校正死亡率达100%，LC50为2.95×107细胞/mL；基因型鉴定表明含有cry7基因，获得了一条总长为3781bp基因序列，其中包含了一个3414 bp的开放读码框，其编码的蛋白由1138个氨基酸残基组成，与Cry7Ab2具有99.65%的序列同源性，存在4个氨基酸差异，亲缘关系最近，该蛋白被Bt 杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3( 登录号为BI 1015188) 。     

苏云金芽孢杆菌WB9菌株cry2Ac4基因的克隆及表达

WB9是我国分离自武夷山的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株,经PCR-RFLP鉴定含有cry2Ac基因。根据cry2基因序列设计引物,以WB9质粒为模板扩增cry2Ac全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD18-T连接获得含有cry2Ac全长基因的重组质粒pMD2Ac并测序。该基因在GenBank上登录号为DQ361267,被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ac4。通过亚克隆方法将cry2Ac4基因插入穿梭表达载体pHT315获得重组表达质粒pHT2Ac,将其转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73 Cry-,得到的工程菌能正常表达70 kD蛋白,形成方形晶体。生物测定结果表明,cry2Ac4基因表达产物对桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)幼虫具有显著的毒杀作用,但对小菜蛾(Plutella xylostella)和致倦库蚊(Culex fatlgans)幼虫基本没有效果。     

苏云金芽孢杆菌Ly30株cry1Ac基因的克隆及表达*

Bt菌Ly30株是中国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定。它含有cry1Ac基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pET-21b相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌(Eschrichia coli),获得含有cry1Ac基因重组质粒pEKLy1Ac。该基因的亚克隆和序列测定结果表明,其编码区为3534bp。编码蛋白分子量为133.5kD,含1177个氨基酸,等电点为4．8,与CrylAc3同源性最高,存在4个氨基酸的差异,与Cry1Ac10之间则有6个氨基酸的不同。该基因序列已在GenBank中登记注册为AF482767,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac14该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133．5kD蛋白带。室内生物测定结果表明,诱导表达的Cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性,其LC5o值分别为19.236和3276μg／g饲料。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性

B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源.     

苏云金芽孢杆菌高效杀蚊菌株BRC-ZLL13的鉴定

苏云金芽孢杆菌BRC-ZLL13是一株从白玉兰叶片中分离的高效杀蚊菌株。它对埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊的毒力均高于国际标准菌株以色列亚种IPS82,其生长速度也明显快于后者。本实验对该菌株毒力、血清型、生理生化反应、药敏实验、质粒、杀蚊基因和晶体蛋白等方面的生物学特性进行了研究。结果显示,BRC-ZLL13与对照菌株IPS82同属于以色列亚种,均含有cyt1、cyt2、cry4A、cry4B、cry10和cry11等杀蚊基因,二者在生理生化反应、药敏实验和晶体蛋白图谱等生物学特性上也表现出极高的相似性。另一方面,前者比后者少2条质粒带,这可能是导致BRC-ZLL13生长速度较快的主要原因。综上所述,笔者认为该菌株在公共卫生和生物防治领域具有开发和应用潜力。     

乙草胺降解菌筛选及其初步鉴定

乙草胺是农业生产中用量较大的除草剂之一,长期频繁大量使用在农田土壤和水体中形成积累,影响到土壤肥力和环境生态安全。筛选到乙草胺降解菌36株,实验室纯培养条件下,72 h对初始浓度50 mg/L乙草胺的降解达到0.43%~37.98%。16S rDNA基因分析比对结果显示,筛选到的34株降解菌在系统发育地位上分别属于假单胞菌(Pseudomonas)、无色杆菌(Achromobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、微杆菌(Microbacterium)、Parapusillimonas、短杆菌(Brevibacterium)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、苯基杆菌(Phenylobacterium)8个属。菌株203-08和204-05与已知菌株16S rDNA最大相似性低于97%,系统发育地位尚不确定。     

几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定

摘要： 从小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、黑麦草（Lolium sp.）和柳树（Salix sp.）的根际土壤中分离得到能在无氮培养基上生长的29株芽孢杆菌（Bacilli），通过固氮酶活的测定以及固氮酶结构基因 nifH 的PCR扩增得到7株固氮芽孢杆菌。对这7株固氮菌株进行了生理生化性状测定、16S rDNA序列分析(GenBank accession No. AY373358, AY373360,~AY373364和AY376876)、G+C mol%含量的测定及DNA-DNA杂交实验，结果表明，其中5株菌属于芽孢杆菌，另外2株菌属于类芽孢杆菌。在这7株被鉴定的菌株中，菌株T1被鉴定为Bacillus cereus；菌株G1、C4和C5被鉴定为B. megaterium；菌株W5的生理生化性状、16S rDNA和G+C mol%与Bacillus marisflavi 相近；G2的生理生化性状和16S rDNA 与Paenibacillus polymyxa 接近，但在基于16S rDNA的系统发育树中却与P. durus 聚在最小的分支内；T7可能是Paenibacillus属中的一个新种。     

广西桑树细菌性枯萎病菌致病力和遗传多样性分析

从广西9个县市采集具有典型枯萎症状桑树样品和发病田块土壤样品,经分离纯化获得致病性菌株105株。依据在桑树品种桂桑优12的致病性强弱,将广西桑树细菌性枯萎病菌株分为强致病力（57株）、中等致病力（17株）和弱致病力（31株）三种致病型。对48个代表性致病菌株进行16S rDNA和rpoB基因序列测定,同源性分析和系统进化树分析结果显示,这48个菌株分别为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae（16株）、阿氏肠杆菌（E.asburise）（13株）、桑肠杆菌（E.mori）（7株）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）（3株）以及未确定种的肠杆菌属（Enterobacter sp.）3株、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）6株。阿氏肠杆菌和阴沟肠杆菌出现的频率最高,是广西的优势菌株。研究结果表明,广西桑树细菌性枯萎病菌具有丰富的遗传多样性。     

Autochthonous halotolerant plant growth-promoting rhizobacteria promote bacoside A yield of Bacopa monnieri (L.) Nash and phytoextraction of salt-affected soil

Phytoremediation is a promising approach for reclamation of salt-affected soil. Phytoextraction is the most commonly used process, which exploits plants to absorb, immobilize, and accumulate salt in their shoots. In this study, halotolerant plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) were isolated from the rhizosphere of wild grasses growing naturally in salt-affected areas of Lucknow, Uttar Pradesh (India) and were tested for their efficacies of salt-tolerance and plant growth-promoting (PGP) abilities. Based on 16S rRNA sequences, the most efficient halotolerant isolates possessing PGP traits were identified as Pseudomonas plecoglossicida (KM233646), Acinetobacter calcoaceticus (KM233647), Bacillus flexus (KM233648), and Bacillus safensis (KM233652). Application of these isolates as bio-inoculants significantly (P < 0.05) increased the growth and bacoside A yield of a medicinal plant, Bacopa monnieri (L.) Nash, grown on natural salt-affected soil. The phytoremediation of salt-affected soil was evident by the substantial increase in shoot Na⁺:K⁺ ratio of bio-inoculant-treated plants. When compared to un-inoculated control plants, the soil physico-chemical properties of bio-inoculant-treated plants were improved. The shoot and root biomass (fresh and dry weights), soil enzymes, and soil nutrient parameters showed significant positive correlations with the shoot Na⁺:K⁺ ratio. Consequently, the halotolerant PGPR screened in this study could be useful for the reclamation of saline soils concomitant with improved plant growth and bacoside A yield.     

Isolation and characterization of potassium solubilizing bacteria in some Iranian soils

The ability of a few soil bacteria to transform unavailable forms of potassium (K) to an available form is an important feature in plant growth-promoting bacteria for increasing plant yields of high-K-demand crops. In this research, isolation, screening, and characterization of six isolates of K solubilizing bacteria (KSB) from some Iranian soils were carried out. The ability of all isolates were tested in three treatments including acid-leached soil, biotite, and muscovite by analyzing the soluble K content after 5 days of incubation at 28 ± 2°C. Identification and phylogenetic analyses were also carried out by morphological, biochemical, and 16S rDNA analyses. Among the six efficient isolates, five isolates belonged to Bacillus megaterium (JK3, JK4, JK5, JK6, and JK7), while isolate JK2 belonged to Arthrobacter sp. The soluble K contents in all isolated-treatments were significantly (p < 0.01) higher than the contents in nonbacteria treatment. Herein, isolate JK2 had lower potential for K solubilization (910 mg kg^?1) compared with other isolates in acid-leached soils. The six bacterial strains showed higher solubilized K in biotite treatment than other two treatments. Overall, it can be concluded that the isolates belong to B. megaterium are the most efficient KSB under in vitro condition.     

Cadmium Affects the Interaction Between Peas and Root Nodule Bacteria

This study investigated the ability of Rhizobium soil inoculants isolated from cadmium (Cd)-contaminated soils to form effective symbioses with peas in the presence of Cd. With Cd present, certain isolates induced high pea dry matter production; an isolate, G, from 399-ppm Cd soil induced high nitrogen uptake and one from 33-ppm Cd, C, soil accelerated Cd uptake. Promising isolates regarding Cd response were used to inoculate various pea selects. Transmission electron microscope analyses showed differences in Cd tolerance between bacterial isolates and pea selects.     

Isolation and identification of boron-accumulating bacteria from contaminated soils and active sludge

High levels of boron are toxic to living organisms. The removal of boron from contaminated water is an important way of dealing with this environmental problem. For this purpose, we screened for bacteria that can absorb high levels of toxic boron from the environment. A range of boron-accumulating bacteria was isolated from boron-contaminated soil in Turkey, from uncontaminated soil in Tokyo, Japan, and from active sludge in Tokyo by semi-quantifying the boron accumulation of each single-cultured bacterium. Intracellular boron concentrations ranged from 0.3 to 1.36 nmol g⁻¹ dry weight. Nineteen isolates identified by 16S rRNA gene sequence analysis were most closely related to the genera Bacillus , Variovorax , Pseudomonas , Shewanella , Mycobacterium and Rhodococcus . To our knowledge, this is the first study examining a wide range of bacterial strains in terms of boron accumulation.     

禾谷镰刀菌拮抗菌株的筛选及鉴定

禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病能够导致小麦产量的大幅降低和品质的严重损失。为探索赤霉病生物防治方法,本试验从扬花期被禾谷镰刀菌侵染的麦穗上分离得到28株芽孢杆菌,利用平板对峙法对其进行筛选,其中20株菌对禾谷镰刀菌表现出明显的拮抗作用。根据生理生化特性和16S rDNA序列分析,这20株拮抗菌分别被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(11株)、解淀粉芽孢杆菌(2株)、枯草芽孢杆菌(2株)、暹罗芽孢杆菌(3株)和特基拉芽孢杆菌(2株)。这些菌株能够有效降低小麦赤霉病的发病率、发病程度和病情指数,其中菌株JS62N、JS15E和JS29I能够将赤霉病发病率降低80%以上;菌株JS29I、JS62N、JS39C和JS39D能够将赤霉病发病程度降低80%以上。16株菌能将病情指数降低80%以上;所有菌株均能极显著增加小麦的百粒重,JS12Q效果最好(+101.4%)。本研究结果为小麦赤霉病的防治提供了生物防治材料。