山药PAL基因全长cDNA序列的克隆、表达与分析

为了阐明苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC4.3.1.5)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的分子机理,本研究运用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技术从大薯(Dioscorea alataL.)’Zixiao’地下块茎中克隆到同一个PAL基因的3个片段,即长度分别为1 145bp、1 151bp和424bp的中间片段、3’端和5’端的cDNA序列;将3段cDNA序列拼接后获得大小为2 376bp的PAL基因全长cDNA序列,该序列含有一个1986bp的最大开放阅读框(ORF),一个28bp的5’端非翻译区,一个362bp含25 nt的Poly(A+)尾的3’端非翻译区,最大ORF可推测编码一个包括PAL酶活性中心的特征序列(GTITASGDLVPLSYIA)在内的661个氨基酸的多肽,分子量为71.974kDa,等电点6.310;大薯地下块茎的PAL基因分别在核苷酸与氨基酸水平上和GenBank中所选已知其他物种的同源性为73%~77%和76%~82%,说明PAL基因在系统进化上相对保守;RT-PCR分析表明该基因仅在地下块茎中表达,而且表达丰度在收获前逐渐降低。     

棕色棉类黄酮3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及色素合成途径中相关基因表达特性研究

为探讨花色苷途径在彩棉色素形成中的作用及彩棉色素形成规律,本研究根据葡萄(Vitis vinifera)的类黄酮3'-羟化酶(flavonoid3'-hydroxylase,F3'H)基因全长cDNA序列blast所得棉花(Gossypium hirsutum)的EST序列(GenBank登录号:DT545210,CO071403和BG447485)设计引物,以开花后16d的新彩棉5号(XC-5)纤维为材料,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和RT-PCR方法分离得到了2个类黄酮3'-羟化酶基因的全长cDNA序列,长度为1761和1892bp,均含有一个97~1629bp、长度为1533bp的开放阅读框,编码510个氨基酸,将这两个序列命名为GhF3'H-1和GhF3'H-2,分别提交GenBank,登录号为HM598123和HM598124,此2个序列编码区完全相同,仅在3'非翻译区(UTR)存在片段长短的差异。半定量RT-PCR检测花色苷合成途径中查尔酮合成酶(chalcone synathase,CHS)基因、F3'H、类黄酮3',5'-羟化酶(flavon...     

高等植物基因上游可译框架（uORF）的分析

真核生物mRNA 5’非编码区上游可译框(uORF)在基因翻译水平上的调控具有重要作用。对植物2200多个cDNA序列5’非编码区的uATG和uORF进行统计分析，结果表明，含uATG的基因高达18％，这一比例比估计的10％要高得多，其中含单个uATG的基因约占50％，含2个uATG的基因占20％左右；大部分uORF属于非交叉uORF，约占85％：编码1～5氨基酸的uORF占30％以上，大部分uORF编码多肽小于20个氨基酸，占77．6％；mRNAORF起始密码子ATG的两边序列有显著的偏爱性，与植物共有序列UAAACAAUGGCU或AACAAUGGC基本一致，但有uATG的mRNA ORF起始密码子ATG的两边序列比不含uATG的mRNA ORF起始密码子ATG的两边序列偏爱性要差。大多数uATG两边序列缺乏植物ORF起始密码子ATG的两边序列的偏爱性。不同种属mRNA5’非编码区uORF氨基酸并不具有显著的同源性，如果植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶等少数基因具有非常保守的uORF，氨基酸序列同源性高达75％～100％，显著高于植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶之间的同源性。     

团头鲂和广东鲂生长激素cDAN的分子克隆和序列分析

从团头鲂（Megalobrama amblycephala）和广东鲂（Megalobrama hoffmanni）的脑垂体组织提取总RNA,采用3′－RACE－PCR的方法,从中扩增出编码两种鲂生长激素（growth hormone,GH）成熟肽的cDNA序列,克隆到pGEM-T Easy Vector载体上。克隆的团头鲂和广东鲂GHcDNA均包括编码188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和3′端的非翻译区,但不含信号肽序列和5′端非编码区。序列分析结果表明,团头鲂和广东鲂GH的碱基序列和推测的氨基酸序列的同源性分别为99％和100％。     

陆地棉GhSUMO基因的克隆与黄萎病菌诱导表达分析

SUMO化修饰与植物抗病防御、信号转导和耐旱等有着直接的关系。本文以抑制差减杂交（sup—pression subtractive hybridization．SSH）技术获得SUMO的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和电子克隆,获得了全长为396bp的SUMO基因编码区cDNA全长,我们将该基因命名为GhSUMO,推测该基因编码95个氨基酸。分别以抗黄萎病陆地棉品种豫棉21号的cDNA和DNA为模板,对该基因进行了PCR扩增验证,测序结果表明,GhSUMO基因序列与电子克隆序列一致,且没有内含子。蛋白序列分析表明,该蛋白具有保守泛素结构域和C端双Gly的断裂／连接位点,以及保守的疏水表面和Ulpl—Smt3互作位点。系统进化分析表明,该蛋白与蓖麻的同源序列表现了最高的相似性,与其它双子叶植物同源序列次之,而与单子叶植物的相似性较低。棉苗接菌后实时定量PCR结果显示,该基因表达量在接黄萎病菌的量48h后明显上调,96h达到未接菌对照的5倍以上。GhsSUMO基因可受黄萎病菌诱导表达,表明该基因在陆地棉抗黄萎病的机制中可能发挥重要作用。     

早酥梨抗黑星病相关新基因Vnp1的克隆及其表达分析

在前期已克隆得到的早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)抗病基因同源类似物Pb-Zs3(GenBank登录号:EU939783)的基础上,通过RT-PCR获得Pb-Zs3的cDNA序列,并利用RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,命名为早酥梨抗黑星病相关基因(Vnp1),提交至GenBank(GenBank登录号:FJ763188).生物信息学分析表明,早酥梨Vnp1基因的全长cDNA序列为1200 bp,包含一个完整的921 bp的开放读码框架(ORF),编码306个氨基酸残基,预测其分子质量为34.6 kD.同时,该基因含有与抗病相关的功能结构域核酸结合位点(NB-ARC),同源性比对显示其与苹果黑星病菌(Venturia inaequails)诱导后的苹果EST序列ABEA004598(GenBank登录号:EB150292)同源性达71%.对早酥梨Vnp1基因进行半定量RT-PCR研究的结果表明,该基因在梨黑星病菌(Venturia nashicola)诱导后216 h内的叶片中的表达水平呈明显上升趋势.     

猪MYL4基因的克隆及其在猪胚胎骨骼肌中的表达分析

克隆了猪(Sus scrota)MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证.所得cDNA序列全长1105 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸.序列分析表明,该基因与已报道的狗(Canis lupus familiaris)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)和恒河猴(Macaca mulatta)等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%.该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域.荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌(妊娠33、65和90d)中的表达,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33天时中外猪品种间无显著差异,但在第65和90天时长白猪中显著高于通城猪.     

总状毛霉(Mucor racemosus)甲壳素脱乙酰酶全长cDNA的克隆及序列分析

用保守的特异引物进行PCR扩增,结合RACE技术,分离和克隆到了总状毛霉(Mucorracemosus)甲壳素脱乙酰酶(CDA)的全长cDNA,并进行了全序列测定,提交GenBank登陆号DQ538514。研究结果表明:(1)总状毛霉CDA基因全长为1506bp,包括67bp5'非翻译区,1344bp阅读框以及95bp3'非翻译区,3'非翻译区包含Poly(A)加尾信号AATAAA。总状毛霉的CDA基因共编码448个氨基酸,在该基因中部还包含一个144氨基酸的多糖脱乙酰酶结构域,约占CDA基因全长的32%。(2)总状毛霉CDA基因与其它相近种米根霉(Rhizopusoryzae)、卷柄根霉(Rhizopuscircinans)的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉(Mucorrouxii)、卵形孢球托霉(Gongronellabutleri)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2的基因序列同源性分别为:75%、58%、56%、56%、48%、39%、39%、17%和16%;相应的氨基酸序列的同源性分别为:69%、57%、59%、55%、47%、30%、32%、18%和21%。表明CDA基因在不同的真菌中有着不同的亲缘关系。(3)根据总状毛霉CDA基因的氨基酸序列构建的不同真菌的系统树,与采用经典分类法构建的系统树基本一致。(4)通过生物信息学的方法,预测该基因所编码的蛋白质三级结构,验证了该蛋白质具有甲壳素脱乙酰酶完整的功能性结构,并包含一个多糖脱乙酰酶结构域,两者具有相似的空间结构。     

甘薯多酚氧化酶cDNA的克隆及序列分析

植物多酚氧化酶（olyphenol oxidase,PPO)是一类核编码的铜金属酶，含有2个保守的铜结合区域（CuA和CuB)，N端和C端部分缺乏明显的同源性。根据植物PPO的结构特点，从2个保守的铜结合区域的氨基酸序列设计一对简并引物，扩增了甘薯（Ipomoea batatas L.) PPO保守区之间的cDNA片段，测序表明该片段含595bp，编码195个氨基酸，推导的氨基酸序列包含了植物PPO的2个保守的铜结合区域，与葡萄（Vitis vinifera)，番茄（Lycopersicon esculentum)马铃薯（Solanum tuberosum)和蚕豆（Vicia faba)PPO保守区的同源性分别为71．3％，80．8％，79．8％，70．6％。在此基础上设计引物通过3'RACE和5'RACE的方法获得了甘薯PPO cDNA的3'和5'端的片段。最后根据保守区的cDNA片段，3'RACD片段和5'RACE片段的序列信息进行拼接，推导出甘薯PPO cDNA的全部序列信息。结果表明：甘薯PPO cDNA全长含1984bp，有完整的阅读框，编码588个氨基酸。另外5'非翻译区16bp,3'非翻译区202bp，其中包括1个多聚腺苷酸化信号AATAAA，以及1个含17个腺苷酸的ploy(A)尾。由甘薯PPO cDNA推导的氨基酸邓列由葡萄，番茄，马铃薯和蚕豆PPO cDNA推导的氨基酸序列进行比较，它们之间存在较明显的同源性，同源性分别为49％，48％，47％和49％。     

棉花MADS-box蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作，以中棉所36（CCRI）均一化全长cDNA文库为基础，结合EST测序分析，分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA。该基因cDNA全长1079bp，包含一个732bp的完整的开放阅读框，编码234个氨基酸，具有典型的MADS-box结构域和完整的K区，命名为GhMADS-13（GenBank：FJ409870）。与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性。实时定量RT-PCR分析表明，GhMADS-13在CCRI36的花器官发育中早期表达量逐步增加，后期有下降趋势。推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。     

棉纤维发育重要基因FbL2A的SNPs研究及定位

利用PCR技术在7个四倍体棉种(Gossypium hirsutum L.和G.barbadense L.)和2个二倍体祖先棉种(G. herbaceum L.和G. richmondii U.)中扩增出棉纤维发育重要基因FbL2A, 分析了不同材料间存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。根据TM-1和海7124两个材料中FbL2A基因的测序结果, 采用NEBcutter软件分析, 选择BstUⅠ内切酶酶解扩增产物, 利用Mapmaker v3.0b作图软件将FbL2A基因定位到第14染色体。另对该基因在4个陆地棉高强纤维品系间的SNPs位点进行了分析，发现编码区的SNPs位点中存在非同义突变，可能与陆地棉纤维品质等表型相关。     

甘蔗Lea基因cDNA全长克隆及表达特性

本研究从甘蔗叶片全长cDNA文库中获得了甘蔗Lea基因cDNA全长序列,命名为Sc-Lea。该基因全长921 bp, 含有一个495 bp编码164个氨基酸的的开放阅读框(open reading frame, ORF), 5’端非编码区（untranslated region,UTR）长64 bp,3’端UTR长362 bp,且在3’端UTR有明显的polyA结构, 起始密码子周围为CCCCAGCCATGGC, -3、+4位为G,C是该段序列的偏好碱基,符合Kozak规则。目的基因原核表达产物分子量大小约为17.9kD。同时还利用定量PCR技术研究了该基因在水杨酸（SA）、H2O2 PEG和NaCl等四种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。研究结果表明,甘蔗Lea基因的表达,会受到PEG和NaCl的强烈诱导,以及H2O2的抑制,同时也会受SA的影响。推测甘蔗Lea基因在甘蔗的抗旱和抗盐机制中发挥作用。     

陕229干旱复水诱导基因表达及小麦乙烯受体(TaERS)基因特征分析

为了解小麦响应水分胁迫后复水条件下的基因表达特征,以小麦(Triticum aestivum L.)主栽品种陕229的3叶1心期幼苗为材料,采用消减杂交技术,构建了干旱复水条件下的SSH-cDNA表达文库。从消减文库中随机挑选59个插入片段大于400bp的阳性克隆测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得高质量EST序列32条(GenBank登录号为ES466767~ES466798)。序列比对分析表明,小麦干旱后复水的基因表达与植物对其他非生物胁迫的响应具有交叉性;17条EST序列与已知编码蛋白的基因同源性较高,涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控等方面;其他序列为新的EST。以其中一个与乙烯受体基因(ERS)同源性较高的EST序列为基础,采用同源克隆及RACE技术从小麦中分离了4个乙烯受体基因的全长cDNA序列,长度分别为2090、2271、2216和1886bp。4个全长cDNA序列所编码氨基酸序列的同源性极高(99%以上),且均具有ERS典型的GAF、HisKA和HATPase-c跨膜结构,分别命名为TaERS1(HM347272),TaERS2(HM601437),TaERS3(HM601438)和TaERS4(HQ111523)。植物ERS氨基酸序列多重比较表明,小麦与水稻的相似性最高(93%);TaERS基因的全长cDNA序列间比较共发现SNP位点23个。定量PCR表达分析显示,小麦TaERS家族基因参与了小麦植株响应水分胁迫和复水的调控机制。研究结果有助于进一步认识小麦干旱后复水的基因表达谱和小麦水分高效利用机制,探索小麦乙烯受体在水分高效利用中的作用。     

陆地棉巯基蛋白酶抑制剂基因克隆及其氨基酸序列分析

通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...