伪狂犬病毒中和抗体与gB-ELISA抗体阻断率之间的相关性

为了测定伪狂犬病毒中和抗体与gB抗体之间的相关性,本试验用216份伪狂犬病毒中和抗体阳性血清,对每一份样本作4种不同的稀释(1:1、1:20、1:40、1:80),用Idexx公司的gB-ELISA试剂盒检测.试验结果表明:216份中和抗体阳性血清样品中,有7份gB抗体阴性,阳性检出率为97.8%(209/216);随着中和抗体效价的增高gB-ELISA OD650值降低;gB抗体阻断率随中和抗体效价的增高而增加;对同一份血清样本作1:1、1:20、1:40、1:80稀释,测定结果发现,随着稀释度的增加,gB抗体阻断率逐渐降低,而gB-ELISA OD650值逐渐升高.     

均质荧光复合微球技术定量检测狂犬病病毒中和抗体方法的建立

为实现对狂犬病病毒中和抗体的绝对定量检测,建立了检测中和抗体的均值荧光复合技术。用狂犬病毒糖蛋白标记带有荧光物质Eu3+的纳米微球载体,并用其特异性结合已捕获的中和抗体,根据荧光强弱判定抗体效价。通过试验我们获得了最佳反应条件;在此条件下,荧光强度与中和抗体效价具有良好的线性关系,相关系数能达到0.99以上;而且检测灵敏度能达到0.01IU/mL;另外此方法对犬温热病毒和犬细小病毒阳性血清不产生交叉反应,具有良好的特异性;并且与金标准FAVN的符合率达到98%。此方法不仅能够用于狂犬病毒中和抗体的特异性检测,而且能够实现绝对定量检测;在狂犬疫苗免疫效果评价和动物的检验检疫等应用中具有重要意义。     

犬细小病毒血凝抑制抗体和中和抗体的关系

对８份犬细小病毒免疫的犬血清同时进行中和（ＳＮ）抗体和血凝抑制（ＨＩ）抗体检测。结果,ＳＮ抗体和ＨＩ抗体具有正比线性关系,ＳＮ抗体近似于６倍ＨＩ抗体,其中ＨＩ抗体检测可在３ｈ内获得结果,操作简便,通过测定ＨＩ抗体效价即可推算出ＳＮ抗体的效价。     

三种ELISA方法与荧光抗体病毒中和试验检测狂犬病抗体的一致性分析

为筛选合适狂犬病抗体检测的试剂盒,该研究以荧光抗体病毒中和试验（fluorescent antibody virus neutralization FAVN）方法为参照,与3个ELISA试剂盒方法进行比对,进行一致性分析,并计算了三种试剂盒的敏感性和特异性。结果显示：三种不同的试剂盒中,试剂盒A与FAVN一致性最好,Kappa值为0.605,有较高的一致性,符合率为86%;试剂盒B次之,Kappa值为0.485,为中度一致,符合率为80%;试剂盒C与FAVN的一致性最差,Kappa值为0.310,符合率也最低,为74%。在敏感性和特异性方面,试剂盒A的敏感性最高,为92.1%,试剂盒B的特异性最高,为72.7%。本研究为临床上科学的筛选试剂盒提供了依据。     

测定狂犬病病毒中和抗体的微量免疫酶试验

在Kazuakz等报道的微量免疫酶技术(MIET)的基础上,以健康细胞对照孔OD值均数加3倍标准差作为间接ELISA判定标准,进而建立了求中和剂量的新方法.通过用中和99%病毒的一致判定标准同经典的小鼠中和试验(MNT)比较看,本试验所建立的方法可代替MNT.     

广东省部分城市犬和猫狂犬病病毒血清中和抗体的调查分析

通过对广东省部分城市宠物犬和猫狂犬病病毒中和抗体效价现状进行调查分析,探讨其风险点及改善点,为狂犬病的防控及公共卫生安全提供参考。调查于2020-2021年期间在广东省佛山市、深圳市、东莞市、云浮市、江门市等地城区采集宠物犬、猫血清735份,并对相关个体信息进行收集,采用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对所有血清样本进行了狂犬病中和抗体效价的测定和分析。结果显示,所有样本狂犬病抗体保护水平阳性率为46.9%,低于世界卫生组织推荐的70%保护水平阳性率;深圳市血清样本抗体保护水平阳性率为55.4%,为采样城市中保护水平阳性率最高;家养猫的保护水平阳性率比家养犬的阳性率低15.5%;犬养殖场样本阳性率比家庭饲养犬样本阳性率低20.8%;流浪动物的保护水平阳性率仅有8.1%。说明广东省部分城市犬、猫狂犬病免疫阳性率偏低,尚无法形成抵御狂犬病侵袭的有效屏障,需在流浪动物管理、猫饲养管理、犬猫饲养场管理等几个方面加强狂犬病的预防管制措施,加强政策引导工作,以提升狂犬病的综合防控能力。     

江汉平原一规模化猪场暴发伪狂犬病的调查研究：Ⅱ,病毒血清中和试验

应用伪狂犬病毒(PrV)阳性参照血清与分离的病毒株HS—9304进行小鼠病毒血清中和试验和IBRS—2细胞培养中和试验时,PrV阳性参照血清可完全中和HS—9304毒株对小鼠的致病力及对猪肾传代细胞系的致细胞病变作用(CPE),这进一步证实了家兔生物学试验的诊断结果,从病死猪大脑及实质器官分离出的HS—9304确系PrV。     

猪伪狂犬病毒Bartha株与变异株疫苗免疫后中和效价比较试验

通当前由于伪狂犬病毒变异株在全国流行,引起人们对疫苗选择的关注,产生是否换用疫苗的不同看法。为了给生产提供疫苗选择的参考,本研究选用某进口猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha株疫苗和某国产PRV变异株疫苗,分别免疫15头仔猪,经2次免疫后第3周采血清,检测血清中和效价,并对结果进行统计分析。结果显示,变异株疫苗免疫后中和效价明显高于该进口Bartha株疫苗。     

阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较

应用阻断ELISA和中和试验2种不同的方法对猪瘟疫苗免疫前后的猪血清抗体进行了检测,在所检测的6头仔猪免疫前和免疫后的12份血清中,2种方法的检测结果相符.应用Western blot对部分血清进行了验证,结果与2种方法检测结果一致,表明阻断ELISA和中和试验结果确实、特异,能真实反映免疫猪群的抗体水平.     

鹅源新城疫病毒云南流行株动物回归试验

用分离的鹅源新城疫病毒KM2007株尿囊液分别接种25日龄非免疫雏鹅和25日龄非免疫雏鸡各20只,对照组每只鸡肌肉注射生理盐水。结果试验组鹅和鸡分别出现典型的鹅新城疫病和鸡新城疫的临床症状和病理变化,对照组全部健活。从发病及死亡鹅和鸡的脑/脾中分离到病毒。试验结果表明,分离病毒KM2007株与鹅自然感染发病的病原一致。     

Molecular characterization of Korean rabies virus isolates

The nucleoprotein (N) and glycoprotein (G) of 11 Korean rabies virus (RABV) isolates collected from animals diagnosed with rabies between 2008 and 2009 were subjected to molecular and phylogenetic analyses. Six isolates originated from domestic animals (cattle and dogs) and five were obtained from wild free-ranging raccoon dogs. The similarities in the nucleotide sequences of the N gene among all Korean isolates ranged from 98.1 to 99.8%, while those of the G gene ranged from 97.9 to 99.3%. Based on the nucleotide analysis of the N and G genes, the Korean RABV isolates were confirmed as genotype I of Lyssavirus and classified into four distinct subgroups with high similarity. Phylogenetic analysis showed that the Korean isolates were most closely related to the non-Korean NeiMeng1025B and 857r strains, which were isolated from rabid raccoon dogs in Eastern China and Russia, respectively. These findings suggest that the Korean RABV isolates originated from a rabid raccoon dog in Northeastern Asia. Genetic analysis of the Korean RABV isolates revealed no substitutions at several antigenic sites, indicating that the isolates circulating in Korea may be pathogenic in several hosts.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建

利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。     

狂犬病病毒糖蛋白在Bac-to-bac杆状病毒系统中的表达及应用

为表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G),本研究通过RT-PCR方法克隆RV Flury LEP病毒株G基因,将其克隆至质粒pFastBacHTα中,重组质粒pFastBac-RV-G转化DH10Bac感受态细胞,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RV-G,将其转染昆虫细胞sf21获得含有G基因的重组杆状病毒.采用SDS-PAGE和western blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析,以重组G蛋白作为包被抗原的ELISA检测36份犬血清样品.结果表明,在Bac-to-bac杆状病毒系统中表达的RV G蛋白能与his-tag单克隆抗体及RV阳性血清发生特异性反应,其相对分子量为60 ku;与以RV为包被抗原的商品化ELISA试剂盒相比,以重组RV G蛋白为抗原建立的间接ELISA的敏感性、特异性和符合率分别为80%、81.8%和80.6%,表明杆状病毒系统表达的RV G蛋白是检测RV抗体的理想抗原蛋白,作为一种亚单位疫苗具有潜在的应用前景.     

狂犬病病毒糖蛋白基因中和抗原表位在大肠杆菌中的串联表达

采用RT-PCR方法从狂犬病病毒HEP株中克隆狂犬病糖蛋白膜外区全长基因。利用突变PCR方法,将糖蛋白基因中三段中和抗原位点串联,克隆至pET-28a表达载体。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达并确定最佳诱导条件。SDS-PAGE电泳结果显示所表达的蛋白大小与预期相符。经Western-blotting检测,串联表达的狂犬病糖蛋白基因中和抗原位点可与狂犬病标准阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因在大肠埃希氏菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒（RV）糖蛋白抗原，采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因，将其克隆于pMD18-T载体，再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因，将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）、pET-32a（＋）和pGEX-4T-1中，经PCR和双酶切鉴定以及序列分析，表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）中进行表达，结果显示，克隆到pET-32a（＋）的糖蛋白膜外区基因表达量最高，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测，不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应，表明，重组蛋白具有良好的反应原性。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒（RV）核蛋白抗原，采用RT—PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了RV核蛋白基因，分别亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）和pET-32a（＋）中，经PCR和双酶切鉴定以及序列测定，重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，表达的核蛋白再经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化。结果显示，核蛋白在pET-32a（＋）中的表达量（30．4％）高于在pET-28a（＋）中的表达量（19．4％），培养物中的高纯度核蛋白产量分别为13．6和8．45mg／L。经Western—blotting检测，不同载体表达的核蛋白均可被兔抗RV多克隆抗体特异识别，表明核蛋白具有良好的反应原性。     

狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因DNA免疫研究

狂犬病病毒(RV)囊膜糖蛋白(G)是该病毒诱导保护性免疫反应的主要抗原.为研究G蛋白基因的DNA免疫效果,本研究构建了表达哺乳动物密码子优化的RVG基因的重组真核表达质粒pCAGG-RVG,间接免疫荧光试验及westem blot结果表明,重组RV G基因在pCAGG-RVG转染的BHK-21细胞中获得正确表达.将pCAGG-RVG按500 μg剂量经肌肉注射途径免疫比格犬,间隔4周以相同剂量、途径加强免疫一次,并于初次免疫前、后不同时间检测血清RV的中和抗体.结果显示,pCAGG-RVG一次免疫即可诱导产生显著的中和抗体反应,二次免疫中和抗体滴度表现出显著地增强效果.二次免疫后,中和抗体滴度缓慢下降,保持持续平稳,至初次免疫后第54周,7只免疫犬病毒中和抗体滴度平均为2.88 IU/mL,并且全部高于0.5 IU/mL,即全部高于对强毒攻击保护的最低中和抗体滴度要求.因此,本研究构建的pCAGG-RVG具有预防狂犬病的潜力,是一种有希望的狂犬病候选疫苗.     

狂犬病毒分离株糖蛋白基因的克隆与序列分析

为分析狂犬病毒(RV)分离株糖蛋白基因之间的差异,本研究采用RT-PCR的方法扩增由广东某地临床表现正常犬的唾液中分离的RV(GD33)分离株的G基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较,结果表明,该分离株与其他毒株相比核苷酸同源性为94%～97.1%;氨基酸同源性为97%～99.2%。而GD33分离株与HEP-Flury株在跨膜区、膜内区有很高的一致性;另外,GD33分离株与HEP-Flury和FluryLEP株在333位点出现精氨酸被取代的现象,证实GD33分离株这2个疫苗株没有显著差异,对监控我国狂犬病疫情具有一定的意义。     

Validation and standardization of virus neutralizing test using indirect immunoperoxidase technique for the quantification of antibodies to rabies virus

A virus neutralizing test using an indirect immunoperoxidase technique (VNT-IIP) for rabies has been developed for the titration of dog and cat serum samples in Japan. The VNT-IIP has the advantage that results obtained can be viewed by the naked eye. The purpose of this study was to validate the VNT-IIP and compare it with one of the international standard methods, the fluorescent antibody virus neutralization test (FAVNT). The VNT-IIP showed satisfactory repeatability, high analytical specificity and good accuracy. Regarding the comparison between the VNT-IIP and the FAVNT, the VNT-IIP showed good agreement (91.9%), high sensitivity (92.8%) as well as specificity (87.0%) and good correlation (r = 0.92). As described above, the validation of the VNT-IIP was satisfactory and the performances of the test proved to be equivalent to those of an international standard method.