大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养及鉴定

探讨大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法,为研究猪链球菌引起脑膜炎的致病机理打下基础.采用脑组织匀浆、二次过筛及酶消化技术分离大鼠脑微血管段,对分离的脑微血管内皮细胞进行了体外培养、形态学观察、免疫荧光鉴定及生长曲线的MTT法测定.结果表明:倒置显微镜下,细胞具有单层"铺路石样"排列的典型特征,免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,成功建立了大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法.     

兔血管内皮细胞的体外培养及生物学特性

为研究兔瘟病毒对兔血管内皮细胞的致病性,建立兔血管内皮细胞的体外培养方法.采用消化法和组织块贴壁法分离获得兔子血管内皮细胞,对其进行体外培养,并对细胞进行第Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学鉴定和CD34的间接免疫荧光检测.结果表明,消化法分离的细胞20 h左右贴壁,约1周长成单层,纯度较高;组织块贴壁法分离的细胞两周才开始...     

大鼠心肌细胞体外培养特性研究

对采用组织块法分离培养的大鼠心肌细胞进行了鉴定及相关的生物学特性研究,以进一步用于心脏细胞工程、组织工程的种子细胞及其他方面的研究。结果显示,分离培养出的心肌细胞呈多种形态,整体形如铺路石样,生长中的心肌细胞常伸出伪足,形状为星形,培养至第4天的心肌细胞常可相互交织形成细胞簇,出现节律性的搏动;心肌细胞的PAS糖原染色呈阳性,胞浆内大量的糖原颗粒被染成品红色;细胞凋亡-Hoechst检测试剂盒荧光染色显示,心肌细胞核内荧光物质分布均匀一致,没有出现细胞凋亡时所特有的荧光致密浓染或碎块状致密浓染现象;对第1代和第6代心肌细胞生长曲线测定显示,心肌细胞生长曲线呈"S"型,2代心肌细胞生长曲线趋于一致;心肌细胞α-sarcomaricactin(α-SA)免疫组化鉴定显示,心肌细胞呈强阳性且具有较高纯度。上述结果表明,利用该方法培养的心肌细胞具有较高的增殖能力和纯度,可作为种子细胞用于心脏的细胞工程和组织工程及其他方面的研究。     

银杏叶提取物对体外培养心肌膜微血管内皮细胞分泌NO和ET-1的影响

研究银杏叶提取物(EGb761)对微血管内皮细胞分泌NO和ET-1的影响。采用体外培养大鼠心肌膜微血管内皮细胞(RMMMVECs)模型,测定其一氧化氮(硝酸还原酶法)和内皮素-1(ELISA法)分泌量的变化。EGb761能显著性提高RMMMVECsNO和ET-1的分泌量,且NO/ET-1值没有显著性变化。     

LPS和LT对体外大鼠肠粘膜微血管内皮细胞的影响

将大鼠肠粘膜微血管内皮细胞分为空白对照组、BSA对照组、LPS1组、LPS2组、LT 1组和LT 2组6个组,分别用维持培养液,含50μg/mL BSA、1或10μg/mL LPS、10或50μg/mL LT的培养液静置培养12 h,研究不同浓度LPS和LT对体外大鼠肠粘膜微血管内皮细胞形态及NO分泌量的影响,并确定LPS和LT致大鼠肠粘膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量。结果表明,LPS可使细胞长宽比增大,间隙变宽,而LT可使细胞肿大,排列紊乱;各浓度的LPS和LT均能引起肠粘膜微血管内皮细胞的NO分泌量升高,但1μg/mL LPS与50μg/mL LT的作用更明显;LPS和LT致大鼠肠粘膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量分别是1和50μg/mL。     

清热中药对大鼠肺及其微血管内皮细胞磷酸二酯酶活性的影响

采用组织贴块法培养分离大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC),以高效液相色谱(HPLC)检测环核苷酸(cAMP)在酶反应前后磷酸二酯酶(PDE)的变化计算PDE活性,并分析药物对其影响,为研究PMVEC特异性PDE抑制剂和清热药作用机理积累资料。结果显示:分离培养经CD31鉴定的PMVEC,其酶量在5~20μL范围内与PDE活性存在良好的线性关系(r=0.9929);17味入肺经清热药均对肺组织cAMP-PDE酶活性有不同程度的抑制作用,其中黄芩、黄药子、青蒿抑制率较高,对肺组织酶分别为:75.37%,72%,61.26%,对PMVEC分别为:66.1%,63.54%,59.39%,结果提示以cAMP-PDE活性为指标,有望筛选出其特异性PDE抑制剂,并揭示入肺经清热药的作用机制。     

大鼠肺及其微血管内皮细胞磷酸二酯酶4表达及活性与清热药影响

通过检测肺与肺微血管内皮细胞（PMVEC）Ⅳ型磷酸二酯酶（PDE4）的表达及其活性,探讨入肺经中药对PMVEC环腺苷酸（cAMP）磷酸二酯酶（PDE）活性的影响,为筛选作用于PMVEC的PDE4抑制剂类抗炎药积累资料。本试验采用RT-PCR测定PDE4的表达,应用高效液相色谱（HPLC）检测酶反应前后大鼠肺组织与PMVEC的cAMP变化,计算PDE活性。结果显示：PDE4A、4B、4C、4D在肺与PMVEC内均有表达;17味入肺经清热药均对肺组织cAMP-PDE酶活性有不同程度的抑制作用,其中黄芩、黄药子、青蒿抑制率较高对肺组织酶分别为：75.37%、72%、61.26%,对PMVEC分别为：66.1%、63.54%、59.39%。由此可见,PDE4所有亚型在肺与PMVEC内均有表达;黄芩、黄药子、青蒿等入肺经的清热药能够抑制肺组织和PMVEC内cAMP-PDE活性;以cAMP-PDE活性为指标,有望筛选出其特异性PDE4抑制剂,并揭示入肺经清热药的作用机制。     

不同高脂饲料建立高脂血症大鼠模型的对比研究

为在短时间内形成稳定适用的高脂血症动物模型,比较了2种不同配方的高脂饲料的建模效果.选用SD雄性大鼠30只[ (200±14.27)g/只],随机分为3组,分别饲喂基础饲料(C组)、高脂饲料Ⅰ(Ⅰ组)、高脂饲料Ⅱ(Ⅱ组)共4周,每周测定体重1次,于第3周末和第4周末测定大鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇( HDL -C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量.结果表明:高脂饲料Ⅰ组与C组比较,体重显著增加(P＜0.05),TC水平极显著升高(P＜0.01),HDL -C和LDL -C水平显著升高(P＜0.05),建模效果优于高脂饲料Ⅱ组.采用高脂饲料Ⅰ饲喂大鼠可在4周内建立稳定的高脂血症大鼠模型.     

大鼠原代肝细胞培养方法的建立

体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多,但均存在一些缺陷。对胶原酶灌流法进行改良,采用细胞密度为6×105个/mL,细胞生长状态好,既能保证细胞活率,又能满足下一步试验要求。用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注,胰酶最适浓度为0.18%,且灌流时维持最适温度37℃,分离得到的肝细胞存活率大于90%,且纯度很高,是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。     

大鼠心肌膜、肺、肠黏膜微血管内皮细胞静息膜电位的检测

比较大鼠心肌膜、肺、肠黏膜微血管内皮细胞静息膜电位,为内皮细胞电生理特性研究提供数据。用植块法培养大鼠心肌膜、肺、肠黏膜微血管内皮细胞,采用膜片钳放大器全细胞记录模式,分别测定3种细胞的静息膜电位。结果表明:心肌膜微血管内皮细胞的静息膜电位为(-24±4)mV;肺微血管内皮细胞的静息膜电位为(-27±6)mV;肠黏膜微血管内皮细胞静息膜电位为(-18±4)mV。3种不同组织来源的微血管内皮细胞在静息膜电位上存在异质性。     

白头翁汤中总多糖对微血管内皮细胞糖萼糖链表达的影响

[目的]研究白头翁汤中总多糖对微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells,MVECs)糖萼糖链的影响.[方法]体外培养猪小肠黏膜MVECs,以50μg/mL白头翁汤中总多糖刺激48 h后,利用凝集素荧光技术检测刀豆凝集素(concanavalin A,Con A)、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)、双花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin,DBA)、荆豆凝集素(ulex europaeus agglutinin Ⅰ,UEA Ⅰ)、花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)、雪花莲凝集素(galanthus nivalis lectin,GNL)、番茄凝集素(lycopersicon esculentum lectin,LEL)受体糖链的表达.[结果]正常情况下猪小肠黏膜MVECs WGA、LEL、Con A和GNL四种凝集素荧光染色呈强阳性,DBA和PNA荧光染色呈弱阳性,UEA Ⅰ荧光染色呈阴性;白头翁汤中总多糖能显著提高WGA和LEL荧光染色的强度.[结论]白头翁汤中总多糖能上调猪小肠黏膜MVECs表达N-乙酰氨基葡萄糖.     

蒲黄黄酮对缺氧损伤血管内皮细胞的保护作用

目的研究蒲黄黄酮对缺氧损伤血管内皮细胞人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)活性、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)含量的影响。方法缺氧诱导血管内皮细胞损伤,MTT比色法观察蒲黄黄酮对血管内皮细胞的影响,酶联免疫法测定细胞培养液中内皮素-1(ET-1)、NO的含量。结果蒲黄黄酮可提高缺氧时HUVE-12细胞活性,减少NO降低程度(P<0.05),抑制ET-1的生成(P<0.05),蒲黄黄酮对HUVE-12细胞的这种保护作用与其浓度存在一定的量效关系。结论蒲黄黄酮对缺氧损伤的血管内皮细胞HUVE-12具有保护作用,其作用可能与NO和ET-1的生成有关。 更多还原     

山羊成纤维细胞体外培养研究

分别采用组织块法与消化法对山羊耳成纤维细胞进行原代培养,比较两种方法的培养效果.结果表明,组织块法培养的细胞生长稳定,5～7d有细胞生长,15～18d长满单层;消化法培养的细胞,通过简化酶作用时间及用量的调控,可得到较为单一的成纤维细胞,且经过4～7d生长后能形成单层.同时对细胞培养过程中常遇到的污染问题及解决方法进行了探讨,为动物组织培养研究提供了实验依据.     

湖羊精原干细胞体外培养

研究了湖羊精原干细胞(SSCs)体外培养方法,湖羊睾丸曲精细管两步酶消化法制备细胞悬液,Percoll分离后比较SSCs纯化方法、FCS以及GDNF对SSCs体外培养与集落碱性磷酸酶(AKP)染色的影响。结果显示,虽然盘化法纯化的SSCs在集落形成时间与集落数上显著低于差速贴壁法(P<0.05),但是盘化法所得集落的AKP阳性率显著高于差速贴壁法(P<0.05);添加1% FCS的培养基可显著降低集落形成的时间,增加集落的数目与AKP阳性率(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率在5%与1% FCS之间无显著变化(P>0.05);20 ng/mL GDNF处理组内集落数与AKP阳性率显著高于10 ng/mL GDNF(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率与30～40 ng/mL GDNF的处理组无显著差别(P>0.05)。     

体外培养肉鸡肺动脉内皮细胞的脂质过氧化损伤

采用组织贴块法培养肉鸡肺动脉内皮细胞(PAEC),并依据细胞形态学特点和凝血因子Ⅷ相关抗原免疫组化染色结果对所培养的细胞进行鉴定.以黄嘌呤/ 黄嘌呤氧化酶(X/XO) 系统作为氧自由基发生系统建立PAEC氧化损伤模型.结果表明:肉鸡PAEC在体外能够存活并传5～6代.形态学观察和Ⅷ因子抗原免疫组化染色检查证明培养的细胞符合肺动脉内皮细胞的特点.氧自由基能够明显损伤PAEC,X/XO系统作用下细胞生长被抑制,甚至导致细胞死亡,并且这种抑制作用对XO有剂量依赖性.与正常对照组相比,损伤组PAEC培养液中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量升高,提示氧自由基促进了PAEC的脂质过氧化.这说明氧自由基对肉鸡肺动脉内皮细胞具有损伤作用,可能在肉鸡肺动脉高压综合征的发病过程中起重要作用.     

内皮源IL-8对PCV2感染猪血管内皮细胞迁移的影响

本研究通过建立PIEC划痕创伤模型,设细胞对照组、接毒组、IL-8抗体处理细胞对照组和IL-8抗体处理接毒组,观察内皮细胞的迁移率,同时用ELISA检测细胞上清中内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF和NO的含量,以探索猪圆环病毒2型(PCV2)对猪血管内皮细胞迁移方面的影响因素。结果显示,接毒组细胞迁移率、上清中bFGF、VEGF含量显著高于对照组;抗体处理细胞对照组上清中bFGF、VEGF、NO含量显著低于细胞对照组;抗体处理对照组和抗体处理接毒组迁移率、上清中bFGF、VEGF、NO显著低于接毒组。以上结果表明,PCV2感染诱导分泌的IL-8可调控内皮细胞bFGF、VEGF、NO分泌而影响猪髋动脉内皮细胞的迁移。     

小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养

为了探讨小鼠卵巢颗粒细胞体外生长的特点及增殖的调控因素,分别添加2μg/mL胰岛素、50ng/mL FSH和20 ng/mL EGF的培养液培养小鼠卵巢颗粒细胞,每隔24 h对细胞进行计数,研究其对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。此外,还对培养过程中出现的卵巢颗粒细胞集落进行了AKP染色和C-kit免疫组化染色鉴定。结果显示,在培养的第4天添加EGF组和FSH组与对照组相比均具有显著的促增殖作用(P<0.05),添加胰岛素组促增殖作用不显著(P>0.05);卵巢颗粒细胞集落经AKP染色和C-kit免疫组化染色均呈阳性。提示EGF和FSH对小鼠卵巢颗粒细胞具有促增殖效应,小鼠卵巢颗粒细胞具有干细胞的部分特性。     

PCV2感染猪血管内皮细胞相关免疫调节分子的表达变化

将猪圆环病毒2型(PCV2)接种猪血管内皮细胞(VEC),于接种后不同时间收集细胞及上清,利用实时荧光定量PCR和ELISA技术分析VEC相关免疫调节分子表达变化。与对照组相比,PCV2感染后血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的mRNA水平变化趋势基本一致,VEGF和M-CSF在感染后12h显著上调,IL-6与M-CSF在48h显著下调;MCP-1和IL-8在感染后4h和48h均显著上调,且IL-8在24h时上调显著,72h下调显著。蛋白水平上,VEGF在4h显著下降,24h显著增高;IL-8在4h和24h显著上升。以上结果表明,PCV2体外感染导致VEC免疫调节功能分子表达异常,其炎性趋化、黏附能力以及对树突状细胞(DC)的分化、成熟等免疫调节功能可能受到影响。     

仔猪神经干细胞体外培养及鉴定

由仔猪脑部海马体齿状回分离得到神经干细胞,利用无血清培养基添加特定生长因子方式培养;采用RT-PCR鉴定神经干细胞和诱导分化后细胞生物特性;利用免疫荧光化学技术检测克隆的细胞抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原表达。由海马体齿状回分离的细胞群具有连续克隆能力;根据免疫荧光检测,脑神经干细胞表达巢蛋白、配对盒因子6和解整合素样金属蛋白酶10;体外培养下NSCs可被诱导分化为神经源性细胞,且表达微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白。分离和培育NSCs细胞结果显示,其具有更新能力和分化为神经元和胶质细胞的潜能,可为干细胞移植提供基础数据。     

猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究

为了建立稳定的血管内皮细胞系,进而为研究猪瘟病毒致病机理提供理想的细胞模型,将脂质体转染的pCIneo-hTERT质粒导入原代猪脐静脉血管内皮细胞中,经G418抗性筛选,挑取阳性克隆并扩大培养。对转染后的细胞进行形态观察,研究其增殖及生长特征,并对其端粒酶活性进行了鉴定。结果表明,转染细胞单层贴壁生长,有接触抑制性,呈铺路石状;F-ⅧAg和CD34免疫荧光鉴定阳性,具有转染前细胞特征;转染后细胞培养代数增加,传至第10代和15代转染后细胞端粒酶活性检测为阳性。说明hTERT转染可以延长猪血管内皮细胞的寿命。