脂肪酸去饱和酶FAD3蛋白特征及其在大豆中的遗传演化分析

微体ω-3脂肪酸去饱和酶(Fatty Acid Desaturase 3,FAD3)是植物种子α-亚麻酸生物合成的关键酶。尽管很多FAD3基因被分离和鉴定，植物FAD3蛋白结构特征及遗传演化研究较少。为了探究脂肪酸去饱和酶FAD3蛋白特征及其在大豆中的遗传演化情况，本研究分析了37个物种(包括33种植物、2种蓝藻和2种真菌)的51个FAD3蛋白的序列特征和进化关系，并分析了大豆3个GmFAD3(GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C)基因在598份材料中的单倍型及其编码蛋白构象。结果发现，植物FAD3蛋白序列和结构较为保守，其进化关系与植物分化进程一致。GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C分别包含14,4和4种单倍型。GmFAD3A-1(Hap1/2)在各大豆种植区域均有分布，Hap3/4/5除华南和西北地区外，其他地区均有分布。虽然GmFAD3A-1(Hap1/2/4)和GmFAD3A-1(Hap3/5)编码蛋白构象差异较大，但可能与地理分布并无关联。而GmFAD3A-2(Hap1～5)编码蛋白构象基本相同，表明GmFAD3A-2可能并未受到选择。GmFAD3B(H...     

野生蕉（Musa spp.，AB group）抗寒基因FAD7的分子克隆与功能分析

以福州旗山国家森林公园野生蕉（Musa spp.,AB group）和福建地方著名栽培品种天宝蕉（Musa acuminata,AAA group）叶片为材料,克隆获得ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD7,并对其 cDNA序列进行生物信息学分析;同时,进行了低温胁迫下FAD7转录水平变化的研究。结果表明,旗山野生蕉FAD7（命名为Mu-FAD7-1,GenBank登录号为JX911314）和天宝蕉FAD7（命名为Ma-FAD7-1,GenBank登录号为KF011506）ORF均为1 371 bp,编码456个氨基酸,两者共有22个差异碱基和10个差异氨基酸残基;生物信息学预测显示,香蕉FAD7编码蛋白为亲水性,不含信号肽,定位于叶绿体;在不同低温胁迫下,天宝蕉Ma-FAD7-1转录水平变化小,而旗山野生蕉Mu-FAD7-1在普通香蕉停止的生长临界温度13 ℃时表达量显著升高,并达到峰值,降至4 ℃时仍然维持较高水平,进一步验证了野生蕉FAD7可能具有抗寒基因的功能。     

南美油藤PvFAD7基因的克隆及其表达模式和功能分析

3 FAD基因是α-亚麻酸合成途径中的一个关键限速酶基因，通过调节该基因的过量表达，可提高植物中α-亚麻酸含量。对南美油藤ω-3脂肪酸脱氢酶基因PvFAD7的克隆及其表达模式和功能分析，有利于探明南美油藤种子高含量α-亚麻酸的合成机制，为下一步利用遗传改良生产植物α-亚麻酸奠定理论基础。基于前期南美油藤种子转录组数据，从南美油藤新鲜叶片同源克隆获得南美油藤脂肪酸脱氢酶基因PvFAD7的DNA全长序列，并对其进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR分析该基因在南美油藤不同器官（成熟叶、新叶、茎、根、果皮、幼嫩种子和成熟种子）中的表达模式，并利用亚细胞定位技术观察该基因的编码蛋白在烟草叶表皮细胞中的定位情况。通过构建过表达载体，介导农杆菌遗传转化获得过表达PvFAD7基因的转基因阳性烟草植株，并对收获的种子利用气相色谱法进行脂肪酸组分的测定。南美油藤PvFAD7基因DNA全长序列为2 222 bp，编码461个氨基酸，包括8个外显子和7个内含子。蛋白多序列比对结果显示南美油藤PvFAD7编码蛋白与同科植物蓖麻和橡胶树同源性最高。生物信息学分析结果表明，PvFAD7蛋白有4个组氨酸保守区，...     

南农87C-38大豆优质11S球蛋白Gy7基因克隆及序列分析

大豆种子不仅富含蛋白质,而且赖氨酸含量较高,利用大豆高赖氨酸基因能够弥补谷类作物种子赖氨酸含量的不足.运用现代分子生物学技术,从高蛋白大豆南农87C-38中克隆11S球蛋白Gy7全基因及cDNA序列.经生物公司测序后,利用vector NTI软件将所克隆的Gy7全基因及cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的序列进行比对分析,同源性分别为99%和99.6%.序列比对结果显示,Gy7基因cDNA与Genbank报道的序列之间所有的核苷酸差异都位于第3外显子.由此推测,第1、第2和第4外显子编码的氨基酸对于G7多肽形成特定高级结构可能具有非常重要的作用,它们在进化过程中受到的选择压力可能比第3外显子更强.根据遗传密码表推测,克隆的Gy7与Genbank报道的cDNA序列所编码的多肽,两者存在2个氨基酸组成的差异.大豆球蛋白Gy7优质基因的获得为今后利用转基因技术改良水稻、小麦等谷类作物的营养品质奠定了基础.     

植物甜蛋白MabinlinⅡB亚基cDNA的克隆与序列分析

依据MabinlinⅡB亚基N端与C端氨基酸序列设计两个简并引物。从马槟榔（CapparismasaikaiLevl．）种子中提取总RNA。经反转录合成cDNA第一链,以此为模板进行多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）产物为近22bp的DNA片段。经克隆及序列测定结果表明,该片段为MabinlinⅡB亚基cDNA的185bp。     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

产ALA光合细菌对陈化大豆种子幼苗建成若干指标的影响

为了降低ALA的生产和应用成本,在实验室条件下评估了产ALA光合细菌的培养物与低浓度商品ALA的溶液对陈化1年的大豆种子出苗和幼苗建成的若干生物学指标的影响。结果表明:供试产ALA光合细菌的培养液的上清液(ALA含量约为0.1~0.2 mg·L~(-1))、菌体悬浮液处理对陈化大豆种子萌发后幼苗株高和根系生长有显著促进作用,但对陈大豆种子的出苗率和幼苗下胚轴粗、鲜重、干重没有显著促进作用,而5 mg·L~(-1)的ALA溶液可显著提高陈大豆种子的出苗率、下胚轴粗、幼苗鲜重,1 mg·L~(-1)ALA可显著提高幼苗株高、下胚轴粗和干重。光合细菌的分泌物和胞外代谢产物对陈大豆种子萌发后幼苗的株高和根系生长有明显的促进作用。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、葵花等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。本文还对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1:1、BnSAD2:1、BnSAD2:2和BnSAD2:3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP (C18:0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18:1-ACP)的过程,尤其是BnSAD2:3可能为种子特异表达基因。     

油用牡丹PEPC 基因的克隆及表达分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是调控植物种子中蛋白质/油脂含量比例的关键酶。利用RT-PCR和RACE技术，从油用牡丹（Paeonia ostii）叶片中克隆得到1个PEPC 基因PaPEPC2（GenBank登录号为：MK606450）。其cDNA全长为3201bp，包含2898 bp开放阅读框，编码965个氨基酸。PaPEPC2 编码蛋白分子量为110.3 kD，理论等电点为5.65，属于酸性亲水性蛋白；二级结构预测表明，该蛋白的主要结构为α螺旋和不规则卷曲。氨基酸序列比对和进化树分析表明，PaPEPC2 基因编码的蛋白属于C3型PEPC，与葡萄的C3型PEPC蛋白（XP_002280569.1）亲缘关系最近。实时荧光定量分析表明，PaPEPC2 基因在茎、叶、花芽和子房中均有表达，其中在茎和子房中的表达水平最高，在花芽中表达水平最低；在种子发育过程中，该基因表达水平呈现先升高，后降低的趋势，其中在发育42 d时表达水平最高；在种子收获后，常温存放7 d时，该基因表达水平最高，随后其表达水平逐渐下降。由此推测， PaPEPC2 基因在油用牡丹种子发育和成熟过程中对油脂和蛋白的合成起阶段性调控作用。     

高油酸低脂氧合酶(FAD-LOX)多基因编辑大豆优异种质创制

大豆是植物油和蛋白质的主要来源。不饱和脂肪酸的含量是影响植物油品质的主要因素，油酸是不饱和脂肪酸中含量最丰富的成分之一，具有较强的氧化稳定性和热稳定性。增加油酸的含量可以提高大豆油的耐储存性，也有利于人体健康。GmFAD2-1A和GmFAD2-1B是大豆编码脂肪酸去饱和酶，调控油酸向亚油酸转化的关键基因。脂氧合酶是大豆种子中的抗营养因子之一。它在酶促氧化的条件下产生豆腥味，限制了大豆产品的应用。为满足不同人群的需要和降低加工成本，有必要培育无脂氧合酶的突变品系。大豆中GmLOX基因(包括GmLOX1、GmLOX2、GmLOX3)编码脂氧合酶。脂氧酶也能催化亚油酸氧化生成脂质氢过氧化物，然后形成豆腥味。因此，降低亚油酸的含量有助于减少豆腥味的形成。同时编码脂氧酶也能延缓豆油的酸败。本研究利用CRISPR/Cas9对中吉602的GmFAD2-1A、GmFAD2-1B、GmLOX1、GmLOX2和GmLOX3基因进行编辑。通过农杆菌介导的大豆遗传转化，在T₂代分离到7个具有不同等位变异的优异新种质。与中吉602相比，突变体种子中脂氧合酶活性显著降低，油酸含量提高至81....     

油菜种子含油量相关的脂肪酶基因BnSDP1克隆与表达分析

通过电子延伸和RACE (cDNA末端快速扩增) 克隆得到一个与油菜种子含油量相关的脂肪酶基因,命名为BnSDP1,其开放阅读框为2 472bp,编码分子量为92kD的蛋白,预测等电点为6.75,具有保守的patatin结构域,跨膜域位于N端和中间,序列分析显示BnSDP1拥有GXSXG脂肪酶的基本特征序列GSSVG。利用RT-PCR技术分析发现,在种子发育的成熟期（即脱水期）,BnSDP1在低油品系种子中的转录水平高于高油品系,在根、茎、叶、花中均有表达,但在根和叶片中表达量高,在根中尤其显著,且受蔗糖诱导上调表达。     

大豆fad3c基因沉默载体的构建

构建大豆fad3c基因的沉默载体,旨在为培育生物安全的高油酸低亚麻酸转基因大豆奠定基础。从高蛋白大豆黑农35中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆黑农37中克隆fad2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆中克隆fad3c基因片段,作为正向臂和反向臂。构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为fad2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,酶切和序列分析鉴定表明扩增得到的重组质粒正确,命名为pDT-GFAD3I。     

花生FAD2-RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析

以花生高油酸品种Sunolic95R和低油酸品种汕油162杂交组合的F1为试验材料,采用AFLP分子标记,用 100 对AFLP引物筛选出20个与△12-脂肪酸脱氢酶-RNAi载体基因遗传连锁距离为3. 87～8.91cm的差异片段,并回收纯化、克隆测序及NCBI上进行序列比对,最终获得了5个FAD2-RNAi载体基因的全序列(长度为589～763bp),通过分析得出:所获得的5个FAD2-RNAi载体基因的遗传连锁距离为3.87～6.59cm,序列间同源性达到88%～97%,与GenBank中已知的FAD2-RNAi载体基因序列相似性均达到85%以上,分别包含一个起始密码子与一个终止密码子,结果表明本试验采用AFLP技术获得的5个序列均为△12-脂肪酸脱氢酶-RNAi载体基因.     

高油大豆品种蛋白质和脂肪积累规律初探

以3个高油大豆品种(绥农14、红丰9、东农47)为试验材料,在2003—2004不同年份探讨高油大豆品种 蛋白质和脂肪积累的变化规律。结果表明:高油大豆品种在不同年份间,脂肪含量的相对排序保持不变。油分含 量高的品种,蛋白质含量年份间变异较小;油分含量低的品种,则变异较大。高油大豆的蛋白质含量积累呈现出 “高—低—高”趋势,并且种子成熟后的蛋白质含量要小于初期测量时的含量;高油大豆脂肪含量积累呈现了“低— 高—低”趋势,并且种子成熟后的脂肪含量要高于初期测量时的含量。     

不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。       

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。     

大豆天冬氨酸途径关键酶基因GmASADH的克隆与分析

本研究基于电子克隆获得的大豆GmASADH 基因cDNA序列,根据其编码区设计特异引物,以大豆品种小鹦哥豆总RNA为模板,通过RT-PCR 获得了约1130bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定。测序结果显示,GmASADH基因家族有两个成员,命名为GmASADH1（FJ581425）和GmASADH2（HM015631）。GmASADH1编码区长度为1134bp,编码378个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm08染色体。GmASADH2编码区长度为1131bp,编码377个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm05染色体。两个基因在氨基酸水平上的相似性达到了96.02%,在二级及三级结构上均有不同程度的差异。ASADH蛋白含有NADB_Rossmann superfamily和Semialdhyde_dhC superfamily结构域。     

矮化大豆GmEXPA5基因的克隆与表达分析

以矮化大豆HK808的顶芽cDNA为模板，根据植物α-膨胀素基因保守区设计简并引物，并克隆保守区片段，结合RACE 技术克隆得到一个新的膨胀素全长基因，将其命名为GmEXPA5（登录号为JN207916.1），该基因全长1 233bp，其中开放阅读框636bp，编码211个氨基酸；推导的氨基酸序列经分析发现，该序列含有两个膨胀素保守域domain1（expansin EG45）和domain2（expansin CBD），无明显的信号肽序列，属于α膨胀素亚家族。构建pEASY-Blunt E1-GmEXPA5重组质粒，获得稳定的原核表达体系，IPTG 诱导后SDS-PAGE 结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。实时荧光定量PCR（real-time PCR）表达分析表明GmEXPA5基因在矮化大豆HK808与野生型大豆东农42两种材料的不同器官中均有表达，而在野生型茎尖及茎部的表达量显著高于矮化大豆，推测该基因与大豆矮化性状的形成可能有一定的关系。     

Aux/IAA基因家族鉴定及对大豆茎尖发育的调控作用分析

Aux/IAA 基因家族在植物茎尖发育过程发挥重要作用。为了探究大豆Aux/IAA 基因家族在大豆茎尖发育过程的调控作用,本文以拟南芥Aux/IAA 基因家族蛋白序列为参照鉴定了大豆全基因组Aux/IAA 家族基因,包括63个成员;然后以拟南芥、鹰嘴豆和大豆的Aux/IAA 家族为研究对象,比对这些基因全长氨基酸序列并构建进化树,结果表明三种作物的Aux/IAA 家族成员间亲缘关系差异明显,进化过程中同源重组频率不同;进而利用RNA-seq技术分析东农594（DN）、Charleston（CH）及二者杂交后代的RIL群体的高矮秆池（WH、WS）和F2群体的高矮秆池（JH、JS）的差异表达基因及其功能,共有17个Aux/IAA 基因在3组材料中差异表达。CHvsDN组有15个差异表达基因,JHvsJS组有2个,WHvsWS组只有1个;其中,Glyma.10G180100 在JHvsJS组和WHvsWS组均差异表达,这些结果为进一步研究大豆Aux/IAA 基因家族的功能及调控茎尖发育提供理论依据。     

RNAi干扰油菜Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNAi介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(β-Actin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明：转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNAi干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNAi干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。