纳豆激酶基因的克隆及表达研究

经PCR扩增获得了纳豆激酶基因(NK).将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/NK.转化宿主菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下进行纳豆激酶的表达研究.SDS-PAGE电泳分析结果表明,重组蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在.     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。     

类人胶原蛋白基因COL6A2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上查到的人胶原蛋白序列COL6A2(NM058175.2),利用Primer 5设计特异性引物,以吉林农业大学生物物理实验室构建的重组质粒pCMV-Sport6-COL6A2为模板进行目的基因的克隆,获得目的基因COL6A2,然后用双酶切的方法连接目的基因COL6A2和表达载体pET32a,将连接产物转化到大肠杆菌中构建原核表达载体pET32a-COL6A2。再将鉴定成功的重组质粒pET32a-COL6A2分别转化到大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(BE3)plysS及Rosetta(DE3)中,采用1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,经12%SDS-PAGE电泳分析并筛选出重组蛋白表达量最高的菌株。利用Ni Sepharose 6 FastFlow琼脂糖树脂亲和层析柱纯化重组蛋白。结果表明:获得了大小为570 bp的COL6A2片段,经测序鉴定序列正确;成功构建了pET32a-COL6A2原核表达载体并表达出约30 kD的目的蛋白;筛选出BL21(DE3)作为高效表达菌株,其重组蛋白表达量占菌体总蛋白的23.9%;经镍离子亲和层析纯化获得了纯度90%的目的蛋白。     

基于信号肽的β-葡萄糖苷酶的分泌表达

为提高大肠杆菌异源表达β-葡萄糖苷酶的底物可及性,本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞,使用信号肽OprI、OsmY、PelB、OmpA将纳豆芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶基因bglH锚定到大肠杆菌BL21(DE3)外膜和周质上.然后使用启动子T7、Trc、LacUV5诱导表达Ⅱ型分泌途径的SecB伴侣蛋白,进而实现...     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是纳豆发酵产氨的关键酶.本文以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板,根据枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列设计引物,进行PCR扩增,再经pMD19-T质粒TA克隆,获得了全长为1275 bp、与RocG基因同源性为98%的纳豆芽孢杆菌GDH的编码基因.构建原核表达载体pET28a-GDH,转化至E.coli BL21(DE3)进行体外诱导表达.表达的包涵体在超声破菌、变性、纯化和复性后,经SDS-PAGE分析得到了47 kDa的特异条带.纳豆芽孢杆菌GDH同时具有NAD+和NADP+依赖活性,酶活分别为6.7723 U·mg-1蛋白和9.4205 U·mg-1蛋白.     

牛胰腺 DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证

从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后,纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明:BL21(DE3),ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常,且未纯化到目的蛋白,BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常,但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白,IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证,酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA,酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散,表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA.     

H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。     

中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。     

金针菇免疫调节蛋白基因克隆及其表达

根据金针菇免疫调节蛋白基因(FIP-fve)合成1对引物,以从金针菇鲜子实体提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到目的片段,构建重组质粒pUC19-FIP-fve,测序将其与pET30a质粒分别用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ酶切,连接,构建原核高效表达载体pET30a-FIP-fve,转化感受态大肠杆菌DE3(BL21),经IPTG诱导该基因在大肠杆菌DE3(BL21)中获得了大量表达。该结果对将金针菇免疫调节蛋白开发为免疫调节、抗过敏、抗肿瘤新药具有重要意义。     

金黄色葡萄球菌Coa基因的克隆、表达及生物活性检测

[目的]克隆金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Coa)基因,并在大肠杆菌中进行融合表达,分析重组蛋白的生物活性.[方法]用PCR法扩增金黄色葡萄球菌Coa基因,构建Coa基因原核表达载体pET32a(+)/coa,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平;将重组蛋白纯化后,测定其...     

马铃薯反义SSU原核表达载体的构建及其对大肠杆菌糖原合成的影响

[目的]为了鉴定马铃薯反义SSU的功能。[方法]利用分子生物学技术,构建了马铃薯反义SSUcDNA原核表达载体(pE-aS),通过0.1mol/LIPTG诱导pE-aS在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,测定糖原的相对含量。[结果]经连接、转化和酶切鉴定筛选出重组表达载体pE-aS,而pE-aS转化BL21(DE3)获得重组菌株BL21-aS。经IPTG诱导的BL21-aS糖原含量OD值为0.409,显著低于对照菌株BL21(DE3)和未经IPTG诱导的BL21-aS,而对照菌株BL21(DE3)和未经IPTG诱导的BL21-aS的糖原含量OD值差异不显著。这表明反义SSU在BL21内表达能够抑制glgC编码的AGPase的形成,从而减少其糖原合成量。[结论]该研究为构建马铃薯反义SSU植物转化载体奠定了基础。     

杜仲EuCHIT1基因表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

构建了T7启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的原核表达载体pET-EuCHIT1和pMCSG-EuCHIT1,其表达产物分别含6个组氨酸(6His)标签和6个组氨酸连接的麦芽糖结合蛋白(his6-tag–maltose-binding protein,MBP)标签,分别将重组载体遗传转化大肠杆菌细胞BL21(DE3),在37℃、150 rpm条件下培养至菌液OD值为0.4~0.8后,转到16℃、150 rpm条件下以1 m MIPTG诱导培养12 h,表达产物经SDS-PAGE分析,p ET-EuCHIT1/BL21(DE3)表达以包涵体形式存在36.03 kD融合蛋白,pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)成功表达可溶形式存在的77.21 kD融合蛋白。故可以使用pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)获得可溶的融合蛋白,为之后的EuCHIT1的多克隆抗体的制备和及功能研究奠定基础。     

产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建与表达研究

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCPAB,转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)(pMCPAB)。对重组菌株诱导的表达产物进行ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白。免疫实验表明,表达产物免疫的小鼠可抵抗α-毒素和β-毒素的攻击。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

Expression of Duck Interferon Alpha in BL21（DE3）plysS

To obtain the protein of duck interferon alpha and study its biological activities, the prokaryotic ex-pression vector of DuIFN-α was constructed and expressed in BL21 (DE3) plysS. Using PCR technique, the proteingene of DuIFN-α was cloned from pMD-18-duIFN-α recombinant. The gene was then inserted to pGEM-T vectorand identified by restriction endonuclease analysis and sequencing. DuIFN-α was ligated with the prokaryotic expres-sion vector of pET30 a, then transformed into BL21 (DE3) plysS. The best inducing time and IPTG concentration for the expression of this recombinant protein was tested through the expression of the positive recombinant with differ-ent time span and different IPTG concentration. Lots of the protein of DuIFN-α were expressed in BL21 (DE3)plysS with 1 mmol·L-1 IPTG for 4 hours and its molecular weight for 34 000.     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白（GZFP）的融合蛋白．以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b（＋）中,转化宿主菌BL21（DE3）,成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET—GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达．     

菠菜胆碱单氧化酶(CMO)基因的克隆及在大肠杆菌中的诱导表达

甘氨酸甜菜碱是一种非毒性的渗透调节物质 ,在植物体内是以胆碱为底物 ,经两步氧化而合成的 .菠菜中 ,催化第一步反应的酶为胆碱单氧化酶 (CholineMonooxygenase ,CMO) .为了研究胆碱单氧化酶基因的功能以及转基因植物的抗逆能力 ,在 30 0mmol L高盐浓度 (n(NaCl)∶n(CaCl2 ) =5 7∶1)的条件下 ,作者分离纯化了菠菜mRNA ,经RT PCR得到全长 (1.3kb)胆碱单氧化酶 (CMO)cDNA ,与已经报道的基因序列相比较 ,同源性为 99% .根据其核苷酸序列推导得到了氨基酸序列 .将PCR纯化产物与pET 30a+ 连接 ,构建了重组表达载体pETCMO ,并转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导获得高效表达 .